T淋巴瘤侵襲轉移誘導因子1在子宮頸癌組織中表達及意義

汪俊，王芳，史亞男

(1.武漢科技大學附屬漢陽醫院，湖北 武漢 430000；2.中山大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510000)

子宮頸癌作為常見的婦科惡性腫瘤，發病率高、病死率高，且發病率呈逐年升高，發病年齡年輕化[1]，監測數據顯示[2]，發展中國家子宮頸癌高發，每年新發病例約占全球發病例的90%，給發展中國家女性健康帶來嚴重威脅。T淋巴瘤侵襲轉移誘導因子1(T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1，Tiam1)作為一種原癌基因，在不同類型細胞形態轉化、細胞遷移、運動、黏附、凋亡等過程中發揮重要作用[3]，有研究指出[4]，Tiam1可通過催化Rho樣鳥苷三磷酸酶(GTPase)并激活Rac1信號通路從而參與腫瘤細胞遷移、侵襲、浸潤等過程。多項研究表明[5-7]，Tiam1在多種惡性腫瘤侵襲轉移過程中發揮重要作用。本研究對子宮頸癌組織、宮頸上皮內瘤變(CIN)和正常宮頸組織中Tiam1基因和蛋白表達進行檢測，探討其在子宮頸癌發生及進展中的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料留取2010年1月至2012年1月在武漢科技大學附屬漢陽醫院行手術切除的子宮頸組織183例，其中，子宮良性病變留取正常宮頸組織43例，年齡(40.2±10.7)歲，年齡范圍30～65歲；宮頸上皮內瘤變(CIN)組織56例(CIN Ⅰ 23例，CIN Ⅱ～Ⅲ 33例)，年齡(39.4±10.1)歲，年齡范圍29～60歲；子宮頸癌組織84例(鱗癌53例，腺癌31例)，年齡(41.3±11.5)歲，年齡范圍31～67歲。三組病例年齡差異無統計學意義(P>0.05)，均衡可比。所有研究對象采集標本前均未接受放化療治療，留取的新鮮組織標本分為兩份，一份立刻置于-80 ℃中保存，一份制備石蠟切片。按國際婦產科聯盟(FIGO)2009年分期標準子宮頸癌患者：Ⅰ期28例，Ⅱ期56例；病理分級：G1 15例，G2 38例，G3 31例；發生淋巴結轉移25例；術后均獲得隨訪，隨訪截止時間2016年12月30日。本研究通過本院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑和設備總RNA提取試劑盒(Trizol法)購自美國Invitrogen，逆轉錄和PCR試劑盒均購自日本Takara，Tiam1和內參引物均由上海生工公司設計合成，SP免疫組織化學試劑盒、DAB試劑、PBS均購自北京中杉金橋公司，兔抗人Tiam1多克隆抗體購自美國Santa Cruz，實時熒光定量PCR儀購自美國ABI，光學顯微鏡購自日本Olympus。

1.3方法

1.3.1利用實時熒光定量PCR技術檢測不同組織中Tiam1mRNA表達 取不同子宮頸組織，研磨后，加入細胞裂解液裂解，用總RNA提取試劑盒提取不同組織中總RNA，利用紫外分光光度計對總RNA純度進行檢測，以A260/A280≥1.80作為合格標準。將總RNA逆轉錄為模板單鏈cDNA，以cDNA為，用PCR試劑盒進行擴增。引物序列：Tiam 1引物：上游：5′-CAGGACTCCACGGGGCCTCA-3′，下游：5′-AGTGCTCCTCGCTCTCCGCA-3′；β-actin引物：上游：5′-CGGG-GTCACCCACACTGTGC-3′，下游：5′-GGGCAGCGGA-ACCGCTCATT-3′。PCR反應條件：94 ℃ 30 s，92 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，連續進行36次循環。每個樣品均設置3個平行反應復孔。用2-△△Ct法獲得不同組織中Tiam1基因相對表達量。

1.3.2利用免疫組織化學法檢測不同組織中Tiam1蛋白表達 石蠟標本經切片、脫蠟、水化后，用3%過氧化氫-甲醇37 ℃孵育30 min對內源性過氧化物酶進行阻斷，PBS洗滌3次，加入檸檬酸緩沖液煮沸10 min，冷卻后，PBS沖洗3次，室溫條件下，滴加10%山羊血清封閉20 min，加入一抗兔抗人Tiam1多克隆抗體(1 ∶500)，4 ℃過夜孵育，PBS沖洗3次，以同型IgG作為陰性對照，加入增強劑，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，加入HRP標記二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次， DAB顯色，蘇木素復染，中性樹脂封片，于光鏡下進行觀察。結果判定[8]：所有切片均由兩位具有副主任及以上職稱的病理科醫師獨立完成，以細胞質中出現黃色、棕黃色或黃褐色染色視為Tiam1蛋白表達陽性：①染色強度：0分，不染色；1分，染成淡黃色；2分，染成棕黃色；3分，染成棕褐色；②陽性細胞比例：0分，≤5%；1分，>5%～25%；2分,>25%～75%；3分,>75%；③總評分=染色強度評分×陽性細胞比例評分。0分，陰性；1～3分,弱陽性；4～6分,中等陽性；7～9分,強陽性；以弱陽性、中等陽性和強陽性作為判斷Tiam1蛋白陽性表達。

2 結果

2.1Tiam1mRNA不同子宮頸病變組織中表達比較PCR結果顯示，子宮頸癌組織中Tiam1 mRNA相對表達量均高于CIN組織和正常宮頸組織，且CIN組織高于正常宮頸組織，均差異有統計學意義(P<0.05)，CIN Ⅰ組織中Tiam1 mRNA相對表達量為(1.54±0.19)，顯著低于CIN Ⅱ～Ⅲ組織的(1.81±0.23)，差異有統計學意義(t=22.186，P=0.016)，即子宮頸癌組織> CIN Ⅱ～Ⅲ組織> CIN Ⅰ組織>正常宮頸組織，詳見表1。

2.2Tiam1蛋白在不同子宮頸病變組織中表達比較子宮頸癌組織中Tiam1蛋白陽性表達率高于CIN組織和正常宮頸組織(P<0.05)，組間兩兩比較采用χ2檢驗，CIN組織高于正常宮頸組織，均差異有統計學意義(χ2=11.726，P=0.001)，CIN Ⅰ組織中Tiam1蛋白陽性表達率為26.1%(6/23)，低于 CIN Ⅱ～Ⅲ組織的60.6%(20/33)，差異有統計學意義(χ2=6.493，P=0.011)，即子宮頸癌組織> CIN Ⅱ～Ⅲ組織> CIN Ⅰ組織>正常宮頸組織，詳見表2和圖1。

表1 Tiam1 mRNA在不同子宮頸病變組織中表達比較

注：與正常宮頸組織相比，aP<0.05；與CIN組織相比，bP<0.05

表2 Tiam1蛋白在不同子宮頸病變組織中表達比較/例(%)

注：與正常宮頸組織相比，aP<0.05；與CIN組織相比，bP<0.05

2.3Tiam1mRNA和蛋白在子宮頸癌組織中表達與臨床病理特征之間的關系子宮頸癌組織中Tiam1 mRNA相對表達量和蛋白陽性表達率均與臨床分期、病理分級、浸潤深度、淋巴結轉移有關(P<0.05)，而均與年齡、病理學類型、腫瘤直徑無關(P>0.05)，詳見表3。

2.4子宮頸癌組織中Tiam1表達與患者預后之間的關系以子宮頸癌組織中Tiam1 mRNA相對表達量P25為界值，將患者分為高表達組(n=63)和低表達組(n=21)，Kaplan-Meier生存分析結果顯示，高表達組患者生存時間44.13個月，低表達組患者生存時間61.00個月，Log-Rank檢驗顯示差異有統計學意義(χ2=6.081，P=0.014)，詳見圖2；子宮頸癌組織中Tiam1蛋白陰性表達患者生存時間63.76個月，陽性表達患者生存時間34.67個月，Log-Rank檢驗顯示差異有統計學意義(χ2=11.359，P=0.001)，詳見圖3。以生存時間為因變量，Tiam1表達(陰性=0，陽性=1)和單因素分析有意義的臨床病理特征為自變量進行Cox比例風險回歸模型分析，結果顯示，臨床分期、淋巴結轉移和Tiam1表達是患者預后的影響因素(P<0.05)，見表4。

表3 Tiam1 mRNA和蛋白在子宮頸癌組織中表達與臨床病理特征之間的關系

注：與G1相比，aP<0.05；與G2相比，bP<0.05

表4 影響患者預后的Cox風險回歸模型分析

圖2 子宮頸癌組織中Tiam1 mRNA相對表達量對生存時間的影響

圖3 子宮頸癌組織中Tiam1蛋白表達對生存時間的影響

3 討論

子宮頸癌細胞具有很強的遷移和侵襲能力，有研究指出[9]，手術時發生盆腔淋巴結轉移的子宮頸癌患者術后復發率高達70%～80%。因此，從分子水平探討影響子宮頸癌細胞遷移、侵襲的相關機制，對該腫瘤早期診斷、提供基因治療靶位及改善患者預后具有重要意義[10]。Tiam1作為一種重要的促腫瘤轉移基因，在調控二磷酸鳥嘌呤核苷酸和三磷酸鳥嘌呤核苷酸轉換，以及催化Ras超家族中發揮重要作用[11]，與細胞形態轉化、骨架結構重構、運動、遷移、侵襲等過程密切相關[12]。有研究指出[13]，Tiam1蛋白在多種惡性腫瘤組織中呈高表達，且與腫瘤分化、浸潤及淋巴結轉移等密切相關。本研究顯示，子宮頸癌組織中Tiam1基因相對表達量和蛋白陽性表達量均高于 CIN組織和正常宮頸組織，且子宮頸癌組織> CIN Ⅱ～Ⅲ組織> CIN Ⅰ組織>正常宮頸組織，說明Tiam1在子宮頸癌組織中呈高表達。

本研究結果顯示，Tiam1 mRNA和蛋白在子宮頸癌組織中相對表達量與臨床分期、病理分級、浸潤深度、淋巴結轉移有關，臨床分期越高、病理分級越高、浸潤深度越深、發生淋巴結轉移，Tiam1 mRNA相對表達量越高，Tiam1蛋白陽性表達率越高，說明子宮頸癌組織中Tiam1表達與子宮頸癌細胞轉移、浸潤、侵襲有關，張源等[14]亦研究發現，Tiam1蛋白表達水平與胃腺癌分化程度、臨床分期、淋巴結轉移及漿膜浸潤有關。這些結果進一步提示Tiam1在腫瘤轉移及侵襲中發揮重要作用，參與了腫瘤進展過程。有研究指出[15]，Tiam1與惡性腫瘤患者預后密切相關，可作為預測患者預后的指標。Li等[16]指出，Tiam1過表達是漿液性卵巢癌患者預后的獨立風險因素。本研究Kaplan-Meier生存分析結果顯示，高表達組患者生存時間44.13個月，顯著低于低表達組患者生存時間，子宮頸癌組織中Tiam1蛋白陽性表達患者生存時間34.67個月，顯著低于陰性表達患者，說明Tiam1表達與子宮頸癌患者預后密切相關，子宮頸癌組織中Tiam1高表達預示患者預后不良，可作為預測患者預后的指標。

綜上所述，Tiam1基因和蛋白在子宮頸癌組織中呈高表達，可能參與了子宮頸癌發生、轉移、侵襲等過程，且與患者預后有關，有望成為患者預后預測的一種潛在分子指標。

(本文圖1見插圖9-2)