人參皂苷Rg1對新生鼠缺氧缺血性腦損傷海馬神經元凋亡及學習記憶能力的影響

雷勛明

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopatly，HIE)是指圍生期窒息缺氧導致腦的缺氧缺血性損害(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)而出現的一系列臨床腦病表現，是圍生期足月兒腦損傷的最常見原因，可引起腦性癱瘓、癲癇、智力低下等嚴重后遺癥[1]。其主要病理改變為腦血管梗死及神經元凋亡、壞死，腦缺血后，因腦組織缺血缺氧，缺血中心區神經細胞發生急性壞死，而在缺血半暗帶區，神經細胞則發生以凋亡為主的遲發性死亡，且凋亡在重新恢復血流供應后不會終止，這與缺血后腦組織損傷面積發展擴大有關[2]。因此，如何挽救瀕死細胞、抑制細胞凋亡以及減少神經元死亡是腦缺氧缺血神經細胞損傷后保護治療重點。人參皂苷Rg1是三七、人參的主要生物活性成分，其具有抗衰老、改善循環、改善神經功能障礙及行為異常、提高機體免疫力等作用[3]。在成人應用心血管疾病治療較多，而在新生兒腦血管疾病中的應用報道較少，因此，該實驗通過對新生鼠HIBD模型后注射人參皂苷Rg1，觀察人參皂苷Rg1海馬神經元凋亡及對其學習能力和記憶力的作用，為臨床新生兒HIE的神經功能和認知行為障礙的康復提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物 15日齡SD乳鼠60只，體質量20～30 g，雌雄不限，由湖北醫藥學院實驗動物中心提供[實驗動物合格證號SCXK(鄂)2016-0005]，按隨機數字表法分為HIBD組、三七皂甙Rg1低劑量組和三七皂甙Rg1高劑量組各20只，飼養環境溫度22～25 ℃，相對濕度50%，自由飲食進水，分籠喂養。

1.2 實驗方法 采用改良的Rice-Vannucci法制備HIBD模型[4]，三七皂甙Rg1高、低劑量組結扎左頸總動脈，HIBD組不結扎。三七皂甙Rg1低劑量組術后每天經腹腔注射人參皂苷Rg1(10 μg/g)，三七皂甙Rg1高劑量組注射人參皂苷Rg1(20 μg/g)，HIBD組每天一次注射相同劑量的生理鹽水，共25 d。

1.3 記憶力和學習能力測試 各組大鼠在注射人參皂苷Rg1或生理鹽水注射25 d結束后即開始進行測試：首先選一個安靜暗室，每天固定在下午5～6點。Y-迷宮為一個三等臂式反射箱，三臂的夾角為120°，底部為可通電的銅棒，每臂端有一信號燈，燈亮表示安全區，此臂不通電無電流，另兩臂通電(電壓50～70 V，大致固定在能使小鼠產生逃避行為的強度)。實驗時，隨機變換安全區，電擊小鼠，以小鼠立即逃往安全區為一次正確反應。具體方法：每只小鼠先在迷宮中適應3 min，每次電擊延遲為5 s，直到小鼠的訓練過程中連續9次正確反應即為學會。記錄小鼠學會所需的訓練次數，訓練次數越少學習能力越好[5]。24 h后進行記憶保持能力的檢測，以正確反應次數占總檢測次數的百分比表示記憶保持能力(正確反應的次數/總檢測次數×100%)。

1.4 海馬神經元凋亡情況 采用TUNEL法檢測實驗鼠海馬CA1區神經元凋亡情況[6]。在學習記憶力測試完成后，各組隨機抽取5只實驗鼠，分離雙側海馬CA1區組織；常規電鏡樣品制備，TUNEL法觀察海馬CA1區神經元凋亡情況，嚴格按照試劑盒說明書進行操作；400倍顯微鏡下，每張切片任意選擇5個視野進行觀察，統計TUNEL陽性細胞總數，以細胞核出現棕黃染色顆粒為TUNEL陽性細胞。

2 結果

2.1 各組實驗鼠學習能力及記憶力測試正確反應率比較 見表1。

表1 各組實驗鼠學習能力及記憶力測試正確反應率比較

注：與HIBD組比較，aP<0.05；與人參皂苷Rg1低劑量組比較，bP<0.05。

表1結果表明，HIBD組學習能力及記憶力測試正確反應率均低于人參皂苷Rg1低劑量組和高劑量組，差異均有統計學意義(P<0.05)；人參皂苷Rg1低劑量組學習能力及記憶力測試正確反應率低于高劑量組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 各組實驗鼠海馬CA1區TUNEL陽性細胞數比較 見表2。

表2 各組實驗鼠海馬CA1區TUNEL陽性細胞數比較個)

注：與HIBD組比較，aP<0.05；與人參皂苷Rg1低劑量組比較，bP<0.05。

表2結果表明，HIBD組海馬CA1區TUNEL陽性細胞數高于人參皂苷Rg1低劑量組和高劑量組，差異均有統計學意義(P<0.05)；人參皂苷Rg1低劑量組海馬CA1區TUNEL陽性細胞數高于高劑量組，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

三七中含有多種皂苷，三七總皂苷是臨床中成人心血管疾病應用較多的成分，具有抗氧化、抗衰老、減輕神經功能損傷的作用。研究表明，三七總皂苷能抑制細胞內鈣離子超載，減少星形膠質細胞的活性氧產生[7]，上調缺血腦組織的神經元特異性烯醇化酶表達[8]。三七總皂苷可抑制受體中一氧化氮的過量產生，減輕缺氧缺血后的神經功能障礙，增加海馬CA1區錐體細胞存活數，對腦缺氧缺血神經元起到保護作用[9]。人參皂苷Rg1是三七總皂苷中藥理最為活性的成分。本研究結果顯示，HIBD組海馬CA1區TUNEL陽性細胞數高于人參皂苷Rg1高、低劑量組，人參皂苷Rg1低劑量組海馬CA1區TUNEL陽性細胞數高于高劑量組，表明人參皂苷Rg1能減少新生鼠海馬神經元凋亡，大劑量應用效果較好。有研究認為人參皂苷Rg1抗神經凋亡具體機制涉及MAPK通路[10-11]。

海馬及其周圍皮質是神經記憶通路的重要組成部分，海馬錐體細胞層神經元的凋亡可能會導致嚴重的學習記憶障礙[12]。有報道電刺激、高壓氧治療可減少梗死灶及其周圍的白細胞浸潤，使氧自由基的產生減少，避免缺血后細胞的死亡，通過神經源性神經保護作用減輕腦損傷和促進腦功能恢復，提高其學習記憶能力[13]。本研究HIBD組學習能力及記憶力測試正確反應率均低于人參皂苷Rg1高、低劑量組，人參皂苷Rg1低劑量組學習能力及記憶力測試正確反應率低于高劑量組，表明人參皂苷Rg1能改善HIBD新生鼠的學習能力和記憶力，且與人參皂苷Rg1劑量有關，大劑量應用時效果較好。其機制與海馬神經元內多巴胺、腎上腺素和5-羥色胺濃度以及腦內M受體濃度有關，這些神經遞質可影響學習能力和記憶力[14-15]。

人參皂苷Rg1能減少新生鼠HIBD海馬神經元凋亡，有效地改善HIBD新生鼠的學習能力和記憶力。然而，人參皂苷Rg1對HIBD海馬神經元凋亡及學習、記憶力的影響機制尚需進一步驗證。