miR-127-3p通過下調靶基因MAPK4抑制神經膠質瘤增殖的機制研究

顏洋 韓美文 汪應瑞

神經膠質瘤(Glioma)起源于外胚層中神經膠質細胞，是中樞神經系統最常見的致死性惡性腫瘤，約占顱內惡性腫瘤的50%[1]。神經膠質瘤好發于成人，腫瘤細胞呈彌漫性生長、侵襲性高、無明確邊界，神經膠質瘤患者的5年生存率低于10%，嚴重危害人類生命健康[2-3]。神經膠質瘤細胞惡性生物學特性是導致臨床上神經膠質瘤患者治療困難的根本原因之一[4]，因此深入研究神經膠質瘤基因遺傳學改變特點及尋找可能的基因治療靶點，對神經膠質瘤的診斷和治療具有重大意義。近年來，微小RNA(miRNA)在人類多種惡性腫瘤發生發展中的作用和機制逐漸得到人們的重視。已經明確多種miRNA同樣參與了神經膠質瘤細胞生物行為學的調控。

miR-127與miR-136、miR-432等同屬1個miRNA簇，位于人類染色體14q32.31上，其前體基因可表達為miR-127-3p和miR-127-5p兩種成熟的miRNA[5]。miR-127可能對腫瘤起著抑制作用，如miR-127在前列腺癌、膀胱癌、宮頸癌等多種癌癥中表達下調，miR-127能通過靶基因COA1和PDIA6抑制巨細胞基質細胞(GCTSC)的增殖[6]。多項研究表明，miR-127在神經膠質瘤中呈低表達[7-8]，但miR-127在神經膠質瘤細胞中的調控作用尚不清楚。本研究擬探討miR-127對神經膠質瘤細胞增殖、凋亡的生物學作用及其可能的靶基因，以期為神經膠質瘤細胞的診斷和治療提供新的理論依據。

1 資料與方法

1.1 病例收集 收集2013年3月-2016年9月本院17例神經膠質瘤患者和15例健康人群腦脊液，所有患者及健康人群均簽署知情同意書，將穿刺獲取的腦脊液快速置于液氮保存，以備后續檢測所用。本實驗部分獲得本院倫理委員會批準實施。神經膠質瘤患者納入標準：①診斷標準參照《中國中樞神經系統膠質瘤診斷與治療指南(2015)》[9]；②所有患者均經術后病理確診。排除標準：① 復發病例；② 保守治療患者；③ 合并有嚴重心、肺、肝、腎等臟器嚴重損壞患者。

1.2 細胞培養與轉染 人神經膠質瘤細胞株U251、U373、U87、SHG44和人腦正常膠質細胞株HEB購自中科院，DMEM培養基、RPMI-1640培養基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素、細胞培養瓶、細胞培養板、MTT試劑、DMSO、凋亡試劑盒等材料均購于碧云天生物有限公司，Lipofectatime 2000(Invitrogen產品)、miR-127-3p mimics和陰性對照物、野生型和突變型MAPK4基因3′UTR熒光素酶表達載體等均購于廣州銳博生物有限公司。Trizol試劑(Invitrogen)、逆轉錄試劑盒(TOYOBO)、PCR試劑盒(TOYOBO)等購自上海吉馬公司，蛋白制膠試劑盒、PVDF膜、電泳等所用化學分析試劑均購于武漢谷歌生物有限公司。兔抗人一抗(Bcl-2、Caspase-3、MAPK4)和山羊抗兔IgG二抗 (HRP)均購于武漢三鷹公司。人神經膠質瘤細胞株U251、U373、U87、SHG44均采用DMEM(含有胎牛血清和雙抗)培養，人腦正常膠質細胞株HEB采用RPMI-1640培養基(含有胎牛血清和雙抗)培養，培養條件為37℃和5%CO2。取U251做瞬時轉染，當U251細胞匯合率達到60%～70%時根據說明書加入轉染試劑、miR-127-3p mimics或陰性對照物進行瞬時轉染，24 h后更換培養基繼續培養并完成下一步實驗。

1.3 MTT實驗 將人神經膠質瘤細胞U251種植于96孔板中，根據轉染miR-127-3p mimics水平設置3個實驗組：50組(轉染水平為50 nmol/L)、100組(轉染水平為100nmol/L)、150組(轉染水平為150 nmol/L)，并設置對照組(轉染miR-127-3p的陰性對照物)。每組設置5個復孔。以轉染的時間為起點(0 h)，分別在轉染后24、48、72 h采用MTT實驗檢測各組細胞的增殖。MTT檢測簡要概括如下：培養結束后在每孔中加入20 mL的5 mg/L的MTT試劑，置于37 ℃中孵育4 h，然后吸去培養基，每孔中加入150 mL的DMSO試劑，室溫避光條件下置于振蕩器上震蕩10 min，然后在酶標儀上上機檢測，測定570nm波長處的吸光度值。

1.4 流式細胞術檢測凋亡 各組細胞在6孔板中轉染結束后吸去培養基，用PBS清洗1遍，用胰蛋白酶消化細胞并收集單細胞懸液，用PBS清洗2遍。按照碧云天Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書1次加入試劑，采用流式細胞儀上機檢測各組細胞早期凋亡和晚期凋亡情況。

1.5 熒光定量PCR Trizol法提取組織或者細胞的總RNA，檢測RNA質量，進行Poly加尾處理，采用TOYOBO公司逆轉錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Kit逆轉錄合成cDNA，然后采用TOYOBO公司SYBR Green Realtime PCR Master Mix上機(實時熒光定量PCR儀，ABI7500，美國)進行熒光定量PCR檢測。miR-127-3p以U6作為內參。miR-127-3p上游引物5′-GGAAGATCTGTAGTCCTGTCTGTTGGTCAG-3′，下游引物5′-CCCAA GCTTCCTGAAGAACTGCTTCCGCC-3′， U6上游引物5′-GCTTCGGCA CATATACTAAAAT -3′，下游引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。2-△△Ct法計算每個樣的mRNA相對表達水平。

1.6 蛋白印跡實驗檢測蛋白水平 采用RIPA試劑裂解并提取細胞總蛋白，采用碧云天BCA試劑盒測定蛋白水平，加上樣緩沖液，100 ℃下蛋白變性，每孔上樣量為20 μg，SDS-PAGE法電泳，電泳結束后進行轉膜，將蛋白通過電轉到PVDF膜上；5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗脫3遍，孵一抗過夜，TBST洗脫3遍，孵二抗2 h，TBST洗脫3遍，最后在暗室中在X線膠片上顯影和定影，然后進行蛋白半定量灰度值分析。

1.7 雙熒光素酶報告基因實驗 采用在線靶基因預測數據庫Targetscan、miRanda預測miR-127-3p的靶基因，結合已發表的文獻研究，確立MAPK4為miR-127-3p的可能靶基因。采用雙熒光素酶報告基因實驗進一步驗證。構建突變型和野生型MAPK4基因3′UTR熒光素酶表達載體(MUT-3′UTR、WT-3′UTR)，并將其分別與miR-127-3p mimic或miR-127-3p陰性對照物，采用Lipofectatime 2000共同轉染入U251細胞，通過熒光素酶報告基因檢測儀檢測各組細胞熒光素酶的活性來鑒定MAPK4是否為miR-127-3p的直接作用靶點。

1.8 統計學處理

2 結 果

2.1 miR-127-3p在腦脊液中的表達水平

神經膠質瘤患者(1.33±0.12)腦脊液中的miR-127-3p相對表達水平低于健康人群(3.62±0.26)(t=5.867，P=0.004)。

2.2 miR-127-3p在細胞系中的表達水平

U251(0.59±0.05)、U373(0.96±0.08)、U87(0.77±0.03)、SHG44(1.28±0.05)中miR-127-3p相對表達水平均低于人腦正常膠質細胞株HEB(3.64±0.26)(P均<0.01)，其中U251細胞株中miR-127-3p相對表達水平最低。

2.3 miR-127-3p抑制U251細胞增殖

轉染后24、48、72 h150組、100組和50組細胞吸光度值均低于對照組(P均<0.05)，并且隨著miR-127-3p mimics轉染水平增高，U251細胞吸光度值越低(圖1)。

圖1 MTT實驗檢測各組細胞增殖 對照組為轉染miR-127-3p陰性對照物;50組為轉染50 nmol/L 的miR-127-3p mimics;100組為轉染100 nmol/L的miR-127-3p mimics;150組為轉染150 nmol/L 的miR-127-3p mimics;與同時間點對照組比較,*P<0.05

2.4 Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡

miR-127-3p mimics轉染組(39.3±4.6%)細胞早期凋亡率高于對照組(7.2±0.6%)(P<0.05)；miR-127-3p mimics轉染組(9.3±2.3%)細胞晚期凋亡率高于對照組(2.4±0.5%)(P<0.05)(圖2)。

圖2 Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡 對照組為轉染miR-127-3p陰性對照物;Mimic組為轉染150 nmol/L的miR-127-3p mimics

2.5 miR-127-3p調控U251細胞凋亡相關蛋白bcl-2、bax和Mcl-1表達水平

mimic轉染組(0.269±0.008)U251細胞bcl-2蛋白表達水平低于對照組(0.556±0.039)，mimic轉染組(0.314±0.015)U251細胞bax蛋白表達水平高于對照組(0.086±0.006)，mimic轉染組(0.144±0.009)U251細胞Mcl-1蛋白表達水平低于對照組(0.426±0.028)(P均<0.05)(圖3)。

2.6 miR-127-3p靶基因預測和驗證

采用在線靶基因預測數據庫Targetscan、miRanda預測miR-127-3p的靶基因為MAPK4，MAPK4 mRNA 3′UTR與人miR-127-3p結合區域如圖4所示。本研究根據預測結合區域序列構建了MAPK4-WT-3′UTR和MAPK4-MUT-3′UTR。雙熒光素酶報告基因實驗顯示，只有當MAPK4-WT-3′UTR與miR-127-3p mimic共同轉染時熒光素酶活性被抑制，這提示miR-127-3p能與MAPK4直接結合(圖5)。

圖3 Western blot檢測細胞蛋白表達水平 對照組為轉染miR-127-3p陰性對照物;Mimic組為轉染150 nmol/L 的miR-127-3p mimics;a為Western blot實驗蛋白條帶圖;b為Western blot實驗蛋白條帶灰度值比,與對照組比較,*P<0.05

圖4 miR-127-3p與靶基因結合位點序列圖

圖5 雙熒光素酶報告實驗 mimic為miR-127-3p mimics;mimic-ctrl為miR-127-3p 陰性對照組;WT-3'UTR為野生型MAPK4基因3'UTR熒光素酶表達載體;MUT-3'UTR為突變型MAPK4基因3'UTR熒光素酶表達載體

2.7 miR-127-3p mimic下調U251細胞MAPK4蛋白表達水平

miR-127-3p mimic轉染組(0.121±0.003)U251細胞MAPK4蛋白表達水平低于對照組(0.467±0.028)(P<0.05)(圖6)。

圖6 Western blot實驗檢測細胞MAPK4蛋白條帶 對照組為轉染miR-127-3p陰性對照物;Mimic組為轉染150 nmol/L的miR-127-3p mimics

3 討 論

本研究結果顯示，miR-127-3p在神經膠質瘤患者腦脊液中表達水平低于健康人群，這為研究miR-127-3p與神經膠質瘤關系提供了臨床依據，并且miR-127-3p可能作為神經膠質瘤診斷標志物。本研究結果與既往發表結果一致，研究者通過基因芯片及生物信息學方法研究顯示，miR-127-3p在神經膠質瘤中呈現低表達[8]。本研究還通過比較人神經膠質瘤細胞株U251、U373、U87、SHG44和人腦正常膠質細胞株HEB中miR-127-3p相對表達水平，結果發現人神經膠質瘤細胞株中miR-127-3p相對表達水平均低于人腦正常膠質細胞株。此外，Jiang等[10]人研究顯示，miR-127-3p在惡性膠質母細胞瘤中也呈現低表達，miR-127-3p通過激活TGF-β信號通路抑制惡性膠質母細胞瘤的增殖。因此， miR-127-3p可能在神經膠質瘤中發揮重要作用。

為深入闡述miR-127-3p在神經膠質瘤中的生物學作用，本研究采用瞬時轉染miR-127-3p模擬物上調神經膠質瘤細胞U251的miR-127-3p表達水平，結果提示上調miR-127-3p能抑制U251細胞增殖且呈劑量依賴性，上調miR-127-3p還能促進U251細胞凋亡。上調miR-127-3p能抑制凋亡相關基因bcl-2、Mcl-1蛋白表達水平以及促進bax的蛋白表達水平。Bcl-2(B-cell lymphoma-2)是B淋巴細胞瘤-2基因，在神經膠質瘤細胞的凋亡過程中起著至關重要的作用[11]。Bcl-2家族成員具有高度的同源性以及具有BH1、BH2、BH3、BH4等相似的保守結構區域。Bcl-2家族成員在神經膠質瘤中并非發揮同樣的作用，Bcl-2家族根據其不同功能可分為抗凋亡和促凋亡兩類，抗凋亡基因主要有Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL和Bcl-W等，屬于腫瘤細胞死亡的負向調控因子，保護神經膠質瘤細胞在化療藥物、放療等外界刺激時免受凋亡；促進凋亡相關基因主要有Bax、Bad、Bid等[12-13]。有研究表明，miR-3175在膠質瘤中表達水平明顯升高，轉染miR-3175抑制物后膠質瘤細胞增殖和侵襲能力得到有效抑制，miR-3175表達下降可導致凋亡相關蛋白Bcl-2、細胞色素C、Caspase-3的異常表達[14]。此外，多種化療藥物、中藥活性成分均能通過調控Bcl-2、Mcl-1和bax基因蛋白表達水平而抑制神經膠質細胞增殖及促進其凋亡[15-16]。因此，miR-127-3p能抑制神經膠質U251細胞的增殖，并促進U251細胞凋亡，其機制可能與調控凋亡相關Bcl-2家族基因有關。

miRNA主要通過與靶基因mRNA 3'UTR區域結合而調控靶基因表達，進而調控靶基因在轉錄后的水平，從而廣泛參與多種惡性腫瘤生物學功能的調控過程[3]。miRNA可能有多個靶基因，多個miRNA也可能調控同1個靶基因。為闡明miR-127-3p調控的靶基因，本研究采用在線靶基因預測軟件預測得到miR-127-3p的可能靶基因是MAPK4，并且通過雙熒光素酶報告試驗證實miR-127-3p mimic能與MAPK4 mRNA的3'UTR區域結合，這提示miR-127-3p能直接作用于靶基因MAPK4。Zhang等[17]人研究表明，miR-127能介導靶基因IL-6基因調控口腔天皰瘡的發生發展。然而，miR-127-3p與靶基因MAPK4結合后是否能發揮功能作用需要得到進一步探討。本研究采用模擬物上調U251細胞的miR-127-3p表達水平，結果發現MAPK4 的蛋白表達水平被抑制，這提示miR-127-3p可能通過直接結合MAPK4而抑制其表達水平。

MAPK4屬于絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族成員之一，參與調控多種細胞的增殖和分化[18]。MAPK在多種惡性腫瘤中存在異?；罨?，張靜等[19]人通過免疫組化分析顯示，MAPK及p-MAPK在人膠質瘤組織中陽性表達區域面積百分率均高于正常腦組織，提示MAPK及其異?；罨c神經膠質瘤的發生發展有關。此外，麥秀英等[20]人采用生物信息學分析表明，胰島素樣生長因子受體Ⅰ的3'UTR有多種miRNAs的結合位點，并參與信號通路中MAPK及PI3K/AKT的調節，從而調控膠質瘤的形成和發展。那么，結合本研究miR-127-3p靶向調控MAPK4的結果，本研究推測miR-127-3p通過下調靶基因MAPK4而抑制神經膠質瘤U251細胞增殖，但miR-127-3p介導靶基因MAPK4調控神經膠質瘤細胞生物學功能的作用仍有待進一步深入研究。

總之，本研究結果表明miR-127-3p在神經膠質瘤患者的腦脊液中呈低表達，上調miR-127-3p能抑制神經膠質瘤U251細胞增殖，促進其凋亡，其機制可能與調控Bcl凋亡相關基因及抑制靶基因MAPK4有關。