甘氨酸通過抑制大鼠創傷性腦損傷后炎癥反應來發揮神經保護作用

唐俊春 潘夢鮮 劉瑞 萬芪

創傷性腦損傷(Traumatic brain injury, TBI)是導致人類死亡及殘疾的重要原因[1]。炎癥反應是TBI后繼發的神經功能損傷的重要原因。TBI后可發生炎癥反應，釋放大量的炎癥因子[1]。很多證據表明TBI后神經細胞死亡和神經功能缺損與炎癥反應有關[2]。甘氨酸(Glycine)是最簡單的氨基酸，為人體非必需氨基酸。近年研究表明甘氨酸具有神經保護作用，能明顯改善缺血再灌注損傷、腦出血等多種神經系統疾病[3]。但甘氨酸對TBI是否也具有神經保護作用，是否調節炎癥反應過程目前尚不清楚。本研究建立大鼠腦損傷模型，探討甘氨酸對TBI后腦水腫、神經細胞損傷及炎癥反應的影響，為甘氨酸對TBI的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型

50只SPF級SD雄性大鼠購自武漢大學動物實驗研究中心，體重250～280 g；按數字表法隨機分為對照(Sham)組、腦損傷+溶劑(TBI+Vehicle)組和腦損傷+甘氨酸(TBI+Glycine)組，TBI模型參照Feeney’s自由落體打擊法[4]；10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉后局部皮膚消毒、切開，暴露顱骨，找到前囟點；將大鼠固定于立體定位儀，以前囟后1.5 mm，中線右側2.5 mm處為中心，用牙科鉆鉆一直徑5 mm骨窗，暴露硬腦膜，注意保持硬腦膜完整；安裝固定顱腦損傷打擊器，將20 g打擊錘從硬腦膜上方20 cm處自由落下，打擊后骨蠟封閉傷口，縫合皮膚；對照組僅去骨瓣后骨蠟封閉。

術后1 h側腦室注射甘氨酸(購自美國Sigma公司)，注射劑量為2 mg/kg；甘氨酸溶于生理鹽水中；腦損傷+溶劑組注射等體積的生理鹽水；術后24 h取腦，用于腦含水量的測定、蛋白免疫印跡檢測，冰凍切片進行Fluoro-Jade C染色和炎癥因子水平檢測。

1.2 腦含水量的測定

TBI后24 h用10%水合氯醛腹腔麻醉后斷頭取腦，取創傷灶附近的腦皮層1塊，約(200±20)mg，電子分析天平上稱濕重后將腦組織置于100 ℃烘箱烘烤24 h，再測干重，腦組織含水量(%)=[(濕重-干重)/濕重]×100%。

1.3 蛋白免疫印跡

10%水合氯醛腹腔注射麻醉，生理鹽水灌注后分離損傷側附近皮層組織，加入含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的裂解液勻漿，12000 r/min 4 ℃ 離心15 min，取上清液；BCA法檢測蛋白水平；10% SDS-PAGE分離膠電泳，轉膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加一抗4 ℃孵育過夜；TBST洗3次后加入相應的二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗后加入ECL顯色液，熒光成像儀成像；蛋白檢測所用一抗：anti-Neun(Monoclonal，1∶500)，anti-GAPDH(Cell signaling technology，1∶2000)。

1.4 Fluoro-Jade C(FJC)染色

大鼠麻醉后分別用生理鹽水、4%多聚甲醛灌注；取腦后冰凍切片，厚度為15 μm；用PBS洗去多聚甲醛5次，乙醇浸洗，0.06%高錳酸鉀搖床震搖10 min，蒸餾水洗滌2次；FJC染液避光染色20 min，蒸餾水洗滌3次，50 ℃烘烤玻片10 min；二甲苯透明2 min后中性樹脂封片；熒光顯微鏡下觀察，并在400倍視野下隨機選取5個視野計數陽性細胞數。

1.5 ELISA實驗

取創傷灶附近的腦皮層少量，制備腦組織勻漿10 min，4000 r/min，離心10 min，取上清液，采用ELISA試劑盒(大連美侖生物技術有限公司)檢測損傷側大腦皮層中炎癥因子白介素1β(IL-1β)，白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達水平。按試劑盒說明書操作。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 Glycine可減輕TBI后腦水腫

TBI后可引起腦組織發生水腫，表現腦含水量增加。如圖1所示，TBI+Vehicle組含水量明顯高于Sham組(P<0.05)，而TBI+Glycine組含水量低于TBI+Vehicle組(P<0.05)。

圖1 TBI后各組腦含水量的測定 與Sham組比較,*P<0.05;與TBI+Vehicle組比較,#P<0.05,n=5

2.2 Glycine減輕皮層神經元損傷

TBI后可誘發或加重神經元損傷。Neun是神經元特異性表達蛋白，其含量可間接反映神經元數量的變化。免疫印跡顯示，TBI+Vehicle組Neun的表達水平顯著低于Sham組(P<0.05)，而TBI+Glycine組Neun表達水平顯著高于TBI+Vehicle組(P<0.05)(圖2)。

2.3 Glycine降低神經元的退化

為進一步研究Glycine對TBI后具有神經保護作用，在TBI后24 h用FJC染色，FJC標記大量退化的神經元(綠色)出現在損傷病灶區的周圍組織中；TBI+Vehicle組退化神經元的數量高于Sham組，TBI+Glycine組退化神經元的數量較TBI+Vehicle組下降(圖3)。

圖2 TBI大鼠損傷側皮層神經元標志物Neun的表達 與Sham組比較,*P<0.05;與TBI+Vehicle組比較,#P<0.05,n=5

圖3 TBI后病灶區周圍皮層FJC陽性神經元數目的檢測 A為各組陽性細胞數;B為陽性細胞所占的相對量;與Sham組比較,*P<0.05;與TBI+Vehicle組比較,#P<0.05,n=5,比例尺=50 μm

2.4 Glycine抑制TBI后炎癥因子的表達

采用ELISA法檢測TBI 24 h后損傷周圍區皮層組織勻漿中炎癥因子的表達水平，TBI+Vehicle組炎癥因子的表達水平顯著高于Sham組，TBI+Glycine組炎癥因子的表達水平低于TBI+Vehicle組(圖4)。

圖4 TBI大鼠損傷側炎癥因子的表達水平 A為各組IL-1β水平的比較;B為各組IL-6水平的比較;C為各組TNF-α水平的比較;與Sham組比較,*P<0.05;與TBI+Vehicle組比較,#P<0.05,n=5

3 討 論

有研究發現TBI大鼠腦損傷后可引起損傷周圍區發生炎癥反應，炎癥因子的表達水平升高[5]。甘氨酸又稱氨基乙酸，是一種化學結構最簡單的氨基酸，也是人體內的一種非必需氨基酸[6]，能被生物體自主合成，為合成其他氨基酸提供氮源。在中樞神經系統中甘氨酸是一個抑制性神經遞質。研究表明甘氨酸在體外和體內的實驗條件下均具有細胞保護和免疫調節的作用[7-8]。重要的是，臨床試驗顯示甘氨酸治療可改善缺血性腦卒中患者的預后[9]。然而，目前還沒有關于甘氨酸與TBI關系的報道。本研究采用Feeney法建立大鼠TBI模型，依據研究報道選取2 mg/kg劑量的甘氨酸在大鼠TBI后1 h給予側腦室注射治療[10]，選擇TBI后24 h取材進行指標測定，結果顯示甘氨酸可減輕大鼠TBI后腦水腫，降低神經元的損傷程度。這些結果提示了甘氨酸對大鼠TBI后有一定的神經保護作用，但其保護機制特別是TBI后炎癥反應是否參與此過程不明確。

炎癥反應對TBI后神經功能的損傷起著重要的作用。有研究表明TBI后腦組織局部發生炎癥反應，釋放大量的炎癥因子如IL-1β、IL-6和TNF-α，破壞了血腦屏障，增加其通透性，進而加劇了腦水腫和神經細胞損傷[11-12]。本研究結果證實大鼠TBI后24 h病灶區周圍皮層的炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平明顯增高，與腦水腫、神經細胞損傷有一定的關系。這提示了炎癥反應在TBI后腦水腫和神經細胞的恢復起著重要作用。與腦損傷+溶劑組相比，腦損傷+甘氨酸組能明顯降低炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平，降低TBI后炎癥反應，這表明了甘氨酸可通過抑制TBI后炎癥反應來起到神經保護作用。但是甘氨酸是如何調控TBI后炎癥因子表達水平的分子機制仍需進一步研究。

綜上所述，甘氨酸對大鼠TBI后具有神經保護作用，其機制可能是通過抑制炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平來減輕TBI后繼發的炎癥反應。