腦出血與TLR4/NF-κB介導(dǎo)小膠質(zhì)細胞自噬的相關(guān)性研究

陸夢茹 朱祖福 張慧萍 孔玉 高志強 楊江勝 陸強彬 柏燕燕 周國慶 沈麗萍

腦出血是指非外傷性腦實質(zhì)內(nèi)血管破裂引起的出血，占全部腦卒中的20%～30%，急性期病死率為30%～40%，發(fā)生的原因主要與腦血管的病變有關(guān)[1]。腦出血在我國的發(fā)病率逐年上升，其具有較大的傷殘率，已嚴重影響患者的生活質(zhì)量和生命健康。因此，深入研究腦出血的發(fā)病機制以及研究腦出血的新治療靶點具有重要的臨床價值和科學意義。對于腦出血的機制研究，多數(shù)研究都是關(guān)注血管內(nèi)皮等細胞，對小膠質(zhì)細胞的研究較少且研究較淺。目前有少量研究結(jié)果表明，小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的自噬反應(yīng)對腦出血后的炎癥損傷起著非常重要的作用[2]。適當激活小膠質(zhì)細胞時可促進腦損傷的自動修復(fù)，但小膠質(zhì)細胞過度活化時將可能加重損傷[3]。小膠質(zhì)細胞自噬的發(fā)生與腦出血炎癥損傷息息相關(guān)。有少量研究表明，TLR4相關(guān)信號通路即TLR4/ MyD88/NF-κB 信號通路參與調(diào)控小膠質(zhì)細胞自噬、炎癥損傷等多個方面[4-6]。但關(guān)于TLR4介導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞自噬在腦出血炎癥損傷中的作用的研究較少。因此，本研究將選取C57BL/6J小鼠作為研究對象，進一步研究TLR4信號通路介導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞自噬與腦出血后炎癥損傷的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

C57BL/6J小鼠、TLR4腺病毒抑制C57BL/6小鼠購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；二抗購自碧云天公司；TNF-α，IL-1β，IL-6檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴增試劑盒均購自坦克拉公司；質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染配套試劑均購自廣州RiboBio公司。TGL-16G-A型高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)；流式細胞儀(BD公司，美國)；7300型實時熒光定量PC電子天平R儀(美國Applied Biosystems公司)；基礎(chǔ)電泳儀(美國Bio-Rad公司)；EL204- (上海特勒-托多利多儀器有限公司)；凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.2 建立腦出血小鼠模型

實驗動物：野生型C57BL/6小鼠。造模方法：用4%水合氯醛麻醉小鼠，之后固定于小鼠腦立體定位儀上；選擇定位坐標為前囟向前0.2 mm，旁開2.3 mm，深3.5 mm;將采集小鼠靜脈血破碎液30 μL，立即用注射泵以2 μL/min速率將自體血注射入定位位點，注射5 μL后暫停7 min，然后再次以2 μL/min速率將剩余25 μL血液注射完畢，之后停留10 min以防止血液回流;當拔出針后用骨蠟對小鼠頭骨進行封閉，縫合皮膚，待小鼠恢復(fù)意識后繼續(xù)正常飼養(yǎng);手術(shù)時保證小鼠體溫維持在(37±0.5)℃左右。

1.3 動物分組與給藥

A組(空白對照組)：野生型C57BL/6小鼠；B組(自噬抑制劑對照組)：野生型C57BL/6小鼠+自噬抑制劑(3-MA)；C組(假手術(shù)組1)：野生型C57BL/6小鼠+假手術(shù)+自噬抑制劑(3-MA)；D組(造模組1)：野生型C57BL/6小鼠+造模+自噬抑制劑(3-MA)；E組(假手術(shù)組2)：野生型C57BL/6小鼠+假手術(shù)+ TLR4腺病毒抑制+自噬抑制劑(3-MA)；F組(造模組2)：野生型C57BL/6小鼠+造模+ TLR4腺病毒抑制+自噬抑制劑(3-MA)。每組各10只小鼠，首先E和F組按照1.2步驟進行手術(shù)造模；C組和D組進行假手術(shù)；接著E組和F組經(jīng)尾靜脈間隔24 h注射腺病毒載體pAdeno-X-siFas1+siTLR4溶液，108pfu/只，其余組尾靜脈注射生理鹽水(NS)；最后B，C，D和F組尾靜脈注射0.1 mol/L的自噬抑制劑(3-MA)；24 h后用1%戊巴比妥鈉麻醉并處死，取小鼠腦組織。

1.4 腦組織含水量(water content of brain，BWC)和神經(jīng)功能障礙評分(neurologic deficit score，NDS)

各組小鼠處死后分別取各組約100 mg的腦組織，用電子天平稱取濕重，記錄數(shù)據(jù)；再放入100 ℃的電熱恒溫箱內(nèi)進行48 h烘烤，重復(fù)測定至恒重；計算腦組織含水量，即BWC(%)=[(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重]×100%。神經(jīng)功能障礙評分： 神經(jīng)功能障礙評分(NDS)按 Garcia 法進行，評分的分數(shù)越低，代表神經(jīng)功能障礙越嚴重。

1.5 Western Blot檢測LC3-II/I比值，TLR4，MyD88，TRIF和NF-κB蛋白表達水平[7]

常規(guī)方法提取組織總蛋白，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)方法測定蛋白質(zhì)水平后進行凝膠電泳，每孔上樣20 ug，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯薄膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上后3%的脫脂奶封閉2 h，分別孵育LC3，TLR4，MyD88，TRIF和NF-κB(目的蛋白)和GAPDH(內(nèi)參蛋白)一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，孵育二抗后顯影。采用Quantityone軟件對條帶亮度進行分析。

1.6 ELISA檢測細胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6水平[8]

取各組血漿，離心，取上清液用于指標測定，采用ELISA試劑盒檢測細胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6水平。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 BWC和NDS

與C組比較，E組BWC和NDS下降(P<0.05)；與D組比較，F(xiàn)組BWC和NDS下降(P<0.05)(圖1)。

圖1 BWC和NDS 與C組比較,*P<0.05;與D組比較,#P<0.05

2.2 Western Blot檢測LC3-II/I比值，TLR4，MyD88和NF-κB p65蛋白水平

A，B，C和D組TLR4，MyD88和NF-κB p65蛋白水平無明顯變化(P>0.05)；與C組比較，E組TLR4，MyD88，NF-κB p65水平、LC3-II/I比值下降(P<0.05)；與D組比較，F(xiàn)組TLR4，MyD88，NF-κB p65水平、LC3-II/I比值下降(P<0.05)。與A組比較，B，C和D組LC3-II/I比值下降(P<0.05)(圖2)。

2.3 ELISA檢測細胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6水平

與A組比較，B，C和D組TNF-α，IL-1β，IL-6水平下降(P<0.05)；與C組比較，E組TNF-α，IL-1β，IL-6水平下降(P<0.05)；與D組比較，F(xiàn)組TNF-α，IL-1β，IL-6水平下降(P<0.05)(圖3)。

圖2 Western Blot檢測各組LC3-II/I比值,TLR4,MyD88和NF-κB p65蛋白水平 與C組比較,*P<0.05;與D組比較,#P<0.05;與A組比較,&P<0.05

3 討 論

腦出血在我國的發(fā)病率逐年上升，其具有較大的傷殘率，已嚴重影響患者的生活質(zhì)量和生命健康。因此，深入研究腦出血的發(fā)病機制以及研究腦出血的新治療靶點具有重要的臨床價值和科學意義[7-8]。對于腦出血的機制研究，目前有少量研究結(jié)果表明，小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的自噬反應(yīng)對腦出血后的炎癥損傷起著非常重要的作用[9]。適當激活小膠質(zhì)細胞時可促進腦損傷的自動修復(fù)，但小膠質(zhì)細胞過度活化時將可能加重損傷。小膠質(zhì)細胞自噬的發(fā)生與腦出血炎癥損傷息息相關(guān)。有研究表明， TLR4與小膠質(zhì)細胞自噬以及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[10]。TLR4是目前研究較多的 TLRs 家族成員。TLR4 在外源性或者內(nèi)源性配體的刺激作用下主要有兩條信號通路，這兩條信號通路分別是 MyD88 依賴途徑和 MyD88 非依賴途徑；在 MyD88 依賴途徑中活化的 TLR4 的胞內(nèi)區(qū)與下游 MyD88 的羧基端結(jié)合，激活下游 NIK(NF-κB 誘導(dǎo)激酶)，接著激活下游 IκB，最終激活NF-κB，而NF-κB p65是這條通路的重要蛋白，故 MyD88 依賴途徑即 TLR4/ MyD88/NF-κB 信號通路參與調(diào)控小膠質(zhì)細胞自噬、炎癥損傷等多個方面[11-12]。NF-kB作為PI3K/Akt及Ras/Raf/MEK/ERK信號通路下游的主要效應(yīng)分子通過調(diào)控下游靶蛋白，密切參與凋亡基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及細胞凋亡的過程[9-11]，激活后可密切參與凋亡基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及細胞凋亡的過程[13-14],這最終導(dǎo)致了效應(yīng)性Caspase 3活化，胞核內(nèi)DNA鏈斷裂，細胞結(jié)構(gòu)的全面解體，細胞死亡發(fā)生[15]。但關(guān)于TLR4介導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞自噬在腦出血炎癥損傷中的作用的研究較少，因此本研究將做進一步探討。

圖3 ELISA檢測細胞因子TNF-α,IL-1β,IL-6水平 與C組比較,*P<0.05;與D組比較,#P<0.05;與A組比較,&P<0.05

本研究結(jié)果表明， E組BWC和NDS較C組明顯下降； F組BWC和NDS較D組明顯下降。這說明給予小鼠TLR4-siRNA進行抑制后可有效減少小鼠腦內(nèi)腦組織含水量(即腦出血含量減少)，卻因阻斷TLR4/ MyD88/NF-κB 信號通路而加重腦出血小鼠的神經(jīng)功能障礙。TLR4-siRNA可抑制TLR4及其下游MyD88、NF-κB p65的表達，同時還可降低相關(guān)炎癥因子TNF-α，IL-1β，IL-6水平。這說明腦出血造模成功后機體的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)激狀態(tài)會引發(fā)機體Th1和Th2細胞免疫失衡，Th2細胞免疫活性呈過度增高狀態(tài)，血清和腦組織中TNF-α、IL-Iβ、和IL-6、等細胞炎性因子的水平顯著增高，激活刺激TLR4/NF-κB信號通路，加重嗜酸性粒細胞的炎性浸潤。自噬相關(guān)蛋白有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式。細胞漿內(nèi)分布LC3-Ⅰ，自噬體的標記常使用LC3-Ⅱ，其反映了自噬體的數(shù)量和檢測標志，主要受mTOR 激酶調(diào)節(jié)。使用自噬抑制劑3-MA后小膠質(zhì)細胞自噬水平下降，LC3-II/I比值降低，mTOR信號通路被阻斷和抑制，無法激活下游靶信號基因NF-κB，使得機體內(nèi)炎癥和免疫反應(yīng)紊亂，Th1和Th2細胞免疫失衡，炎癥因子TNF-α，IL-1β，IL-6水平降低。綜上所述，TLR4-siRNA可抑制TLR4介導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞自噬，從而減輕自噬引起的腦出血炎癥損傷。