脂聯素轉染的內皮祖細胞對糖尿病大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

王美瑤 劉煜敏 李艷 張仁偉 張帥美 封紅亮

缺血性腦卒中在全球范圍內具有較高發病率、致殘率、病死率的特點[1]，2型糖尿病(T2DM)是其主要的危險因素之一。研究表明，T2DM患者比非T2DM患者發生缺血性腦卒中的風險高出2倍，同時合并有T2DM的缺血性腦卒中患者其神經血管損傷也更廣泛，預后更差，再發腦梗死的風險更高[2]。因此，研究T2DM伴發缺血性腦卒中的治療措施顯得尤為重要。近年來隨著干細胞研究和應用的不斷深入，細胞治療逐漸成為了缺血性疾病的治療方法。1997 年得以發現并逐漸闡明的血管內皮祖細胞(Endothelial Progenitor Cells，EPCs)是定居于骨髓中，當缺血缺氧、炎性介質釋放等刺激后從骨髓中向外周循環血液中遷移，定向歸巢到缺血部位進行增殖分化,參與生理性和病理性血管形成的骨髓干細胞[3]，它在促神經血管修復和改善神經功能缺損方面發揮了重要作用[4]。但T2DM患者循環血中EPCs含量降低，其遷徙增殖活性和血管代償性增生的能力下降，其下降程度與缺血性疾病的不良預后呈正相關[5]。脂聯素(Adiponectin，APN)一種主要是由脂肪組織合成和分泌的蛋白質，因其在改善胰島素抵抗、抗糖尿病等方面發揮著廣泛的生物學效應而備受關注[6]。APN除了代謝相關功能，它還具有抗炎作用從而發揮腦保護作用[7]，同時APN還具有參與調控EPCs遷移、增殖、分化功能的作用[8]。我們先前的研究表明APN基因修飾的EPCs可能是治療非T2DM大鼠腦缺血再灌注損傷(I/R)的一種有效的方法[9]。本研究將建立T2DM伴I/R損傷大鼠模型，給予APN轉染的EPCs(LV-APN-EPCs)干預，觀察LV-APN-EPCs對T2DM伴腦I/R損傷大鼠的治療效果及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性SPF級SD大鼠(4周齡、體重90～100 g的大鼠10只；5周齡、體重150～160 g的大鼠70只)，購自湖北省實驗動物研究中心，動物合格證號SCXK(鄂)2015-0018。

1.1.2 主要試劑和儀器 60 kcal%高脂飼料(D12492)購于北京華阜康公司；鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司；血糖儀及配套血糖檢測試紙購于美國Johnson & Johnson公司；EPC專用培養基EGM-2MV培養基購于美國Lonza公司；帶有綠色熒光蛋白和大鼠APN基因的慢病毒載體和帶有綠色熒光蛋白空載基因的對照慢病毒均購于上海吉凱基因公司；CD31抗體購于美國Abcam公司；大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)的ELISA試劑盒均購于南京建成公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立及細胞干預 將70只5周齡SD大鼠隨機分為假手術組(sham組)、對照組(PBS組)、LV-APN-EPCs治療組、LV-EPCs治療組和EPCs治療組，每組各14只；高脂飼料喂養大鼠2周，以35 mg/kg劑量腹腔注射STZ，繼續喂養2周后檢測空腹血糖，含量≥16.7 mmoL/L判定為T2DM大鼠造模成功；麻醉PBS組、LV-APN-EPCs組、LV-EPCs組和EPCs組大鼠，longa法[10]制備I/R模型，sham組除不插入線栓外，其余步驟相同。10只4周齡SD大鼠，梯度密度離心法獲取骨髓單個核細胞層，添加EGM-2MV培養基，于5% CO2和37 ℃的培養箱中培養，每3～4 d更換1次培養基;細胞生長至第7 d隨機分成3組：正常對照組(EPCs組)、攜帶APN基因的慢病毒轉染組(LV-APN-EPCs組)和空白慢病毒轉染組(LV-EPCs組)。EPCs組繼續換液培養，LV-APN-EPCs組和LV-EPCs組細胞消化獲取細胞懸液，按照轉染倍數=100分別按組加入攜帶有綠色熒光蛋白與大鼠APN基因的慢病毒載體和帶有綠色熒光蛋白空載基因的對照慢病毒，培養第14 d消化下各組細胞;T2DM大鼠I/R 1 h后經尾靜脈分別給予LV-APN-EPCs組、LV-EPCs組和EPCs組每只大鼠1×106/ml LV-APN-EPCs、LV-EPCs和EPCs 1mL，在相同時間點經尾靜脈注射sham組、PBS組大鼠PBS溶液1 mL。

1.2.2 神經功能評分 5組大鼠分別于I/R前和I/R后第1、7、14 d，參照改良大鼠神經功能缺損評分(modified neurological severity score，mNSS)[11]進行神經功能評分，評分為0～18分，0分為無明顯神經功能缺損癥狀，18分為神經功能缺損最嚴重。

1.2.3 HE染色 5組大鼠I/R后第14 d行HE染色；10%水合氯醛麻醉大鼠，4%多聚甲醛經心臟進行全身灌注內固定，斷頭取腦，從視交叉前緣始向后切3 mm厚冠狀位腦組織塊，石蠟包埋，連續切片，每片標本厚度約10 μm；常規HE染色，普通光鏡下觀察腦組織形態學改變。

1.2.4 CD31免疫熒光染色 5組大鼠I/R后第14 d，行CD31免疫熒光染色檢測缺血區血管密度;使用CD31抗體對腦切片進行免疫熒光染色后免疫熒光顯微鏡下觀察腦缺血區周圍皮質的新生血管情況，隨機取多個視野計算熒光密度。

1.2.5 缺血腦組織炎癥指標水平檢測 5組大鼠I/R后第14 d，ELISA 法檢測缺血腦組織中腫瘤壞死因子-α (TNF-α)和白介素-1β (IL-1β)水平；10%水合氯醛麻醉大鼠，生理鹽水經心臟進行全身灌注后斷頭取腦，取腦梗死周圍皮質制成勻漿液，根據ELISA試劑盒說明書進行操作檢測炎癥指標水平。

2 結 果

2.1 大鼠T2DM模型評估 高脂飲食結合STZ誘導制備T2DM模型前后各組大鼠的空腹血糖水平見圖1，所有大鼠在誘導后血糖均≥16.7 mmol/L，各組大鼠均出現多飲、多食、多尿等癥狀，判定為T2DM大鼠造模成功。

圖1 各組大鼠糖尿病造模前后血糖水平 與高脂+STZ誘導前比較,*P<0.05

2.2 神經功能評分 T2DM大鼠I/R后第7 d，LV-APN-EPCs組大鼠的mNss評分低于LV-EPCs組、EPCs組和PBS組[(5.60±0.52)與(7.70±0.82)、(8.20±1.14)、(9.30±0.82)分，P<0.05]；I/R后第14 d，LV-APN-EPCs組大鼠的mNss評分低于LV-EPCs組、EPCs組和PBS組[(4.50±0.53)與(6.40±0.52)、(6.50±0.71)、(7.80±0.63)分，P<0.05](圖2)。

圖2 各組T2DM大鼠I/R前和I/R后第1、7、14 d神經功能評分 與PBS 組比較,#P<0.05;與LV-EPCs組和 EPCs組比較,*P<0.05

2.3 各組大鼠腦組織HE染色比較 與LV-EPCs組、EPCs組和PBS組比較，LV-APN-EPCs組大鼠神經元破壞明顯減輕，變性、壞死的神經元減少，間質內浸潤的炎性細胞減少，細胞結構破壞減輕，胞質中空泡減少(圖3)。

2.4 腦組織缺血區血管密度的檢測 免疫熒光顯微鏡觀察顯示，LV-APN-EPCs組大鼠腦組織缺血區皮質血管密度高于LV-EPCs組、EPCs組和PBS組[(209.00±9.25)與(125.00±11.29)、(138.40±9.15)、(80.20±16.22)，P<0.05](圖4)。

圖3 各組大鼠缺血側腦組織病理學表現(HE染色 ×400倍) A為sham組;B為PBS組;C為LV-APN-EPCs組;D為LV-EPCs組;E為EPCs組

圖4 各組大鼠缺血側腦組織血管密度(CD31免疫熒光染色 ×400倍) A為sham組;B為PBS組;C為LV-APN-EPCs組;D為LV-EPCs組;E為EPCs組;與PBS 組比較,#P<0.05;與LV-EPCs組和 EPCs組比較,*P<0.05

2.5 缺血腦組織皮質炎癥指標水平的檢測 ELISA顯示LV-APN-EPCs組大鼠腦組織缺血區皮質TNF-α水平低于LV-EPCs組、EPCs組和PBS組[(236.87±8.10)與(309.78±12.32)、(325.44±16.64)、(385.24±15.33)pg/mL，P<0.05]；LV-APN-EPCs組大鼠腦組織缺血區皮質IL-1β水平低于LV-EPCs組、EPCs組和PBS組[(107.05±12.22)與(125.29±4.22)、(120.68±12.59)、(142.59±8.50)pg/mL，P<0.05](圖5)。

圖5 ELISA法檢測各組大鼠腦組織TNF-α和IL-1β表達水平 與PBS組比較,#P<0.05;與LV-EPCs組和 EPCs組比較,*P<0.05

3 討 論

缺血性腦卒中對人類的健康和生命造成了較大的威脅，缺血性腦卒中的發生減少了腦血流，通過激發血管重塑后促進血管新生而改善血液供應[12]。然而，糖尿病導致血管內皮細胞功能受損和功能失調性血管再生的發生，使缺血性腦卒中的預后更差，對人類的威脅也就更大，故研究治療合并糖尿病的缺血性腦卒中的方法具有重要意義。本研究采用高脂飲食結合低劑量的STZ誘導T2DM大鼠模型，使大鼠處于糖尿病狀態[13]，再采用線栓法制備I/R模型，栓塞大腦中動脈2 h后退出栓線以實現缺血再灌注損傷，模擬臨床上糖尿病患者I/R過程。

目前，血管再生醫學十分令人注目。血管再生是體內修復受損血管的一個重要過程，它包括兩個基本過程，也就是血管生成和血管新生。血管生成從已存在的血管以生芽方式長出新毛細血管的過程，而血管新生是內皮前體細胞(如EPC)分化成內皮細胞，形成原始血管網的過程。EPCs源于骨髓細胞，當受到缺血等刺激時循環到外周血中促進血管內皮細胞修復和促進血管再生。近年來研究表明，EPCs移植治療在各種缺血性疾病中發揮了積極的作用，它定向歸巢到腦缺血區域、增殖分化、參與血管再生，從而發揮腦保護作用。Fan 等[14]研究發現通過移植EPCs治療MCAO小鼠可以改善大鼠的神經功能并減小腦梗死體積。Kong等[14]將骨髓源性的EPCs干預 MCAO模型大鼠，證實EPCs通過促進血管新生形成新的血管。本研究發現EPCs移植可以增加血管密度和改善神經功能，發揮對缺血性腦卒中的保護作用，它可能的機制是低灌注的腦組織釋放炎癥介質，導致EPCs歸巢到腦缺血組織區域，遷移分化為內皮細胞參與血管修復和血管再生，從而恢復血流和改善神經功能。然而，單獨移植EPCs，因僅有少量的EPCs存活并歸巢到腦缺血區域，治療效果不佳，同時糖尿病狀態進一步減少了循環EPCs數量，T2DM大鼠的EPCs的歸巢、遷移、分化、成管等功能受損[15]，使EPCs很難充分發揮其作用。因此，保證EPCs的數量及功能是治療合并糖尿病的缺血性腦卒中的重要手段。

APN在調節糖脂代謝、抗動脈粥樣硬化形成、抗炎、保護血管內皮等方面發揮較大生物學作用[16]。Nakamura等[7]發現APN通過PI 3-kinase/Cdc42/Rac1通路促進 EPCs遷移。Huang等[17]研究證實APN通過增加內皮型NO合酶的表達而減輕高糖狀態下EPCs功能受損。TNF-α和IL-1β是重要的神經炎癥因子，Chen等研究表明APN通過下調TNF-α和IL-1β水平來發揮抗炎作用，有效地改善糖尿病患者的EPCs生物學功能，從而提高EPC治療性血管新生的作用[18]。故本研究將攜帶有APN基因的慢病毒轉染到EPCs，干預T2DM腦I/R損傷大鼠，研究LV-APN-EPCs對I/R的T2DM大鼠的神經保護作用，將對合并有T2DM的缺血性腦血管病的治療提供新的思路。

改良大鼠神經功能缺損(mNSS)評分用于評估大鼠的神經功能，本研究結果表明LV-APN-EPCs治療較LV-EPCs組、EPCs組和PBS組明顯改善了T2DM大鼠I/R損傷的神經功能缺損。通過HE染色觀察發現，LV-APN-EPCs干預后T2DM大鼠神經元的損傷程度減輕。另外，CD31免疫熒光染色顯示LV-APN-EPCs干預后T2DM大鼠腦組織缺血區血管密度均較其他干預組增加，ELISA檢測顯示腦缺血周圍皮質的TNF-α水平和IL-1β水平較其他干預組降低，表明LV-APN-EPCs改善T2DM大鼠神經功能損害可能是通過促進缺血區血管新生，增加缺血區血液供應和抗炎作用來實現的。

綜上所述，本研究證實LV-APN-EPCs對T2DM大鼠腦I/R損傷發揮神經保護作用，其可能的機制是促進缺血區血管的修復、再生和抑制炎癥因子表達。