紫外分光光度法測(cè)定雙黃連粉針劑中總黃酮的含量

馮文軍 李文春 解黎雯 李殿明 付饒

摘 要：目的：建立以黃芩苷作為對(duì)照品，采用三氯化鋁（AlCl3）比色法測(cè)定雙黃連粉針劑總黃酮含量方法。方法：通過(guò)對(duì)雙黃連相關(guān)提取物在AlCl3顯色后的吸收峰（200～500nm）進(jìn)行比較，分析以黃芩苷為對(duì)照品的AlCl3比色法測(cè)定雙黃連粉針劑中總黃酮的合理性。結(jié)果：AlCl3顯色后，雙黃連粉針、黃芩提取物、黃芩苷在336nm處有較強(qiáng)吸收。結(jié)論：采用AlCl3比色法測(cè)定雙黃連粉針劑總黃酮的含量具有合理性，本法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快捷，可作為本藥的質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞：雙黃連粉針劑；總黃酮；三氯化鋁比色法；黃芩苷

中圖分類號(hào)：R286 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2018）14-0218-03

根據(jù)中藥注射劑安全性再評(píng)價(jià)的相關(guān)要求，《中藥注射劑安全性再評(píng)價(jià)質(zhì)量可控性評(píng)價(jià)技術(shù)原則》（試行）明確指出：“多成份制成的注射劑結(jié)構(gòu)明確成分的含量因品種而異；所測(cè)各類成分之和應(yīng)盡可能大于總固體的80%。”“多成份制成的注射劑，含測(cè)指標(biāo)的選擇應(yīng)為大類成份含測(cè)加單一成份含測(cè)，如：某注射劑中含黃酮、皂苷、生物堿等，需要分別建立總黃酮、總皂苷、總生物堿類的測(cè)定，還需分別對(duì)黃酮、皂苷、生物堿中的單一代表成份進(jìn)行含量含測(cè)（HPLC或GC法等）。”因此建立雙黃連粉針劑的總黃酮含量測(cè)定指標(biāo)，以加強(qiáng)制劑質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

METTLER XS205型電子分析天平（梅特勒-托利多（瑞士）有限公司）；TU-1901型 紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；蘆丁對(duì)照品（供含量測(cè)定用，批號(hào)：100080-200306）；黃芩苷對(duì)照品（供含量測(cè)定用，批號(hào)：110715-200514，110715-200815），化學(xué)對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；三氯化鋁，分析純（天津試劑廠）；氫氧化鉀，分析純（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）；冰醋酸，優(yōu)級(jí)純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；醋酸鈉，分析純（哈爾濱市新春化學(xué)試劑廠）；甲醇，分析純（北京化工廠）；其余試劑為市售分析純；雙黃連粉針劑（哈藥集團(tuán)中藥二廠，規(guī)格：600mg/支，批號(hào)：0903237、0903238、0903239、1005206、1005207、1005208、1001230、1001231、1001232）；注射用雙黃連（凍干）（哈藥集團(tuán)中藥二廠，規(guī)格：600mg/支，批號(hào)：0902004、0902005、0902006）；注射用雙黃連（凍干）（哈藥集團(tuán)中藥二廠，規(guī)格：1.2g/支，批號(hào)：1002102、1002103、1002104）。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)方法[1-3]

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取黃芩苷對(duì)照品10mg，置50mL量瓶中，加50%甲醇適量，使溶解，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取20mL至50mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得（每1mL 含黃芩苷0.08mg）。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對(duì)照品溶液0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL，分別置25mL量瓶中，各加水至5mL，加醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（pH=4.5）5mL，再加1.5%三氯化鋁溶液5mL，搖勻，再加水至刻度，搖勻，放置50分鐘，以0mL為空白，照分光光度法（中國(guó)藥典2010年版一部附錄ⅤA），在336nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)，對(duì)照品重量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.3 供試品溶液的制備

取本品40mg，精密稱定，置50mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1mL置25mL量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“置25mL量瓶中，加水至5mL……”起依法測(cè)定吸收度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中黃芩苷的重量，計(jì)算，即得。

2.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定

吸取對(duì)照品溶液4mL、供試品溶液1mL分別置25mL量瓶中，準(zhǔn)確加入pH4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液5mL和1.5%三氯化鋁5mL，加水稀釋至刻度，搖勻，放置50min，以水5mL如上法操作得空白溶液，于紫外可見分光光度計(jì)上，在200～500nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果對(duì)照品溶液和供試品溶液在336nm波長(zhǎng)處均有最大吸收，故確定測(cè)定波長(zhǎng)為336nm。同時(shí)黃芩提取物也在相同波長(zhǎng)處有最大吸收。詳見圖1-4。

2.3 線性關(guān)系的考察

研究方法：2.1項(xiàng)下的2.1.1及2.1.2方法，在336nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)，對(duì)照品重量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算回歸方程為：Y=0.57378X+0.01282，相關(guān)系數(shù)為：r=0.9999。表明黃芩苷在0.0864mg～0.432mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

取雙黃連粉針劑1001232，精密稱定，照供試品溶液制備方法制備供試品溶液。依法進(jìn)行測(cè)定6次。記錄吸收值，結(jié)果平均值為0.4575，RSD=0.12%。由此可見，該方法精密度較好。

2.5 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取雙黃連粉針劑1001232，精密稱定，照2.1.3方法制備供試品溶液。分別在0小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)吸取1mL依法測(cè)定。記錄吸收值，結(jié)果平均值為0.4887，RSD=0.54%。由此可見，該方法雙黃連粉針劑的水溶液，在室溫條件下密閉放置24小時(shí)，穩(wěn)定性良好。

2.6 顯色穩(wěn)定性試驗(yàn)

取雙黃連粉針劑1001232，精密稱定，照2.1.3方法制備供試品溶液。依法測(cè)定，之后每隔25min測(cè)定一次。記錄吸收值，結(jié)果平均值為0.5161，RSD=0.52%。由此可見，該方法150分鐘內(nèi)顯色穩(wěn)定性較好。但隨時(shí)間延長(zhǎng)吸收度有降低趨勢(shì)，因此建議50-100分鐘內(nèi)測(cè)定完成。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取雙黃連粉針劑1001232，精密稱定6份，每份與約40mg，照2.1.3方法制備6份供試品溶液。依法測(cè)定。計(jì)算含量，結(jié)果平均值為34.855%，RSD=0.1.86%。由此可見，該方法重復(fù)性較好。

2.8 回收率試驗(yàn)

取雙黃連粉針劑1001232，精密稱定6份，每份與約20mg，同時(shí)各精密吸取黃芩苷對(duì)照品溶液（相當(dāng)黃芩苷7.23mg），分別加入上述6個(gè)量瓶中，照供試品溶液制備方法制備6個(gè)供試品溶液。依法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定結(jié)果見表1。

由此可見，該方法加樣回收率較好。

2.9 樣品測(cè)定

取15批雙黃連粉針劑其中噴干9批、凍干6批，分別依照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中量測(cè)定項(xiàng)下規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表2，表中數(shù)據(jù)為3次測(cè)定均值。通過(guò)15批雙黃連粉針劑的含量測(cè)定，15批粉針的總黃酮平均含量為33.69%。

3 討論

（1）通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，黃酮含量測(cè)定方法中根據(jù)原理不同有4種方法，分別是三氯化鋁法，酸性三氯化鋁法，氫氧化鉀法（堿溶液法），亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉絡(luò)合比色法。根據(jù)顯色原理第四種方法不能使黃芩苷（由于不含鄰酚羥基）顯色或顯色不明顯，同時(shí)顯色受鄰酚類化合物如綠原酸、連翹酯苷A等的干擾，與郭亞健等[4]報(bào)道一致。研究者曾用蘆丁為指標(biāo)測(cè)定雙黃連中總黃酮約為27%左右，僅與黃芩苷含量相當(dāng)，且黃芩苷對(duì)照品對(duì)吸收貢獻(xiàn)值相對(duì)較小，不可取；前三種方法用黃芩苷為指標(biāo)測(cè)定雙黃連粉針劑（1001232）中總黃酮含量基本相當(dāng)分別為35.2%、34.28%、32.6%，根據(jù)顯色機(jī)理，酸性三氯化鋁最適合雙黃連粉針劑成分的測(cè)定，故選用酸性三氯化鋁法測(cè)定雙黃連粉針劑中的總黃酮，有人使用蘆丁為對(duì)照[5]，蘆丁最大吸收波長(zhǎng)為410nm與黃芩苷、黃芩提取物、成品均不一致，因此對(duì)照品選用黃芩苷，由于金銀花、連翹提取物中均有黃酮類成分，在黃芩苷336nm處均有吸收，能較全面地反應(yīng)二者所含黃酮量。

（2）采用鋁離子與黃酮類成分產(chǎn)生絡(luò)合反應(yīng)并產(chǎn)生相應(yīng)顏色或熒光，可用于定性和定量。顯色原理如圖5：

三氯化鋁顯色法測(cè)定的原理為：在中性及堿性條件下，鄰酚羥基均與Al3+絡(luò)合產(chǎn)生的絡(luò)合物，影響含量測(cè)定的準(zhǔn)確性，只有在酸性環(huán)境下，黃酮醇母核中5位-OH、4位C=O與Al3+絡(luò)合產(chǎn)生的絡(luò)合物，且這個(gè)反應(yīng)具有專屬性。雙黃連中黃酮類成分[6]：金絲桃苷、黃芩苷、野黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素、白楊素（Chrysin）等，其結(jié)構(gòu)中均有5位-OH、4位C=O，并不含有B環(huán)的鄰酚羥基，故該法適合用于雙黃連總黃酮的含量測(cè)定。

參考文獻(xiàn)

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