殼聚糖薄膜誘導間充質干細胞形成球體的研究進展及臨床應用前景

李華杰 徐雄峰 邱波

[摘要] 間充質干細胞（MSCs）來源廣泛并具有多向分化潛能，被視為組織修復重建領域的新希望。但近年的研究表明，傳統的貼壁培養模式改變了細胞生長的原始環境，會導致MSCs自主分化、干性衰退等諸多問題，移植體內后治療效果不佳。研究證據表明，相較于傳統的貼壁培養，3D-球體培養方式對MSCs的生物活性具有顯著促進作用。殼聚糖薄膜（CM）培養是一種新型生物膜誘導MSCs成球方法，本文主要從MSCs形態學、生物功能的變化及其潛在機制方面對MSCs的CM成球培養模式進行綜述，并探討其在MSCs臨床應用方面的潛力。

[關鍵詞] 間充質干細胞；3D-球體；殼聚糖薄膜；干性

[中圖分類號] R318 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）05（b）-0021-05

Research progress and clinical application prospect in 3D-sphere culture of mesenchymal stem cell with chitosan membrane

LI Huajie XU Xiongfeng QIU Bo

Department of Orthopedics， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Mesenchymal stem cells （MSCs） with a wide range of sources and multipotential differentiation are thought as a new hope in the field of tissue repair and reconstruction. However， recent research shows that traditional adherent culture changes the initial growing environment of MSCs， leading to self-differentiation， stemness recession and other problems， which brings a negative effect to the treatment after in vivo transplantation. And the evidence suggests that， compared with the traditional adherent culture， the 3D-sphere culture plays a significant role in promoting the biological activity of MSCs. Chitosan membrane （CM） culture is a new type of biomaterial substrate-mediated multicellular spheroid cultivation for MSCs. This review discusses the CM culture of MSCs mainly from the change of morphology， biological functions and potential mechanisms， as well as its potential in clinical application.

[Key words] Mesenchymal stem cells； 3D-sphere； Chitosan membrane； Stemness

近年來，干細胞尤其是間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）越來越受到醫學研究者的重視，因其具有多向分化潛能被視為組織修復領域的新希望。原代MSCs可以從脂肪、臍帶、軟骨、牙齦等多種組織中獲取[1-2]，特定條件下可分化為脂肪、骨、軟骨等多種類型細胞，在減少腎損傷、肝組織再生、增強傷口愈合等方面均被證實發揮治療作用[3]。然而，近年學者們發現貼壁培養擴增的MSCs生物活性較低[4]，究其原因，MSCs體外平鋪式的生長狀態與其生物體內的團塊聚集模式有很大差異，微環境的改變使MSCs喪失了部分干細胞特性[5]。例如，體外培養通常不能夠維持MSCs的性狀穩定，自主分化、干性衰退，歸巢能力減弱等問題亟待解決[6-7]。殼聚糖薄膜（chitosan membrane，CM）培養是一種新型的生物膜細胞培養法，此種方式可誘導MSCs自發形成細胞球體，對其干細胞特性、移植活力、旁分泌效應、遷徙趨化等生物功能均有促進作用[8]。本文將對CM培養誘導的MSCs球體在形態學、生物功能上的變化及其潛在機制進行綜述，并分析其臨床應用前景。

1 制備CM作培養基底物

殼聚糖是廣泛存在于大自然界中的甲殼素衍生物，是一種帶正電荷的天然多糖，作為組織工程支架材料被廣泛研究[9-10]。制備CM通常取殼聚糖粉末在1%乙酸水溶液中溶解并在室溫下攪拌12 h以獲得1%殼聚糖溶液，以1.5mL/孔均勻涂布于6孔細胞培養板，置于層流柜蒸發24 h。細胞實驗前，形成的CM紫外線暴露過夜，然后用0.5 mol/L NaOH溶液中和處理30 min，用蒸餾水充分洗滌，最后用磷酸鹽緩沖液（PBS）充分洗滌[11]。

2 CM底物培養的MSCs細胞形態學變化及其潛在機制

常規聚苯乙烯平板表面接種后，MSCs表現為成纖維細胞形態的貼壁細胞，增殖后聚集成簇，而在CM作為底物的的培養條件下單個細胞的體積明顯較小，短暫貼壁后聚集為球狀體，并進行性增大[12]。在其他物理方式誘導的MSCs成球培養體系中黏附力較低，細胞之間先通過細胞外基質（extracellular matrix，ECM）和整合蛋白的相互接觸從而形成松散的多細胞團塊，之后細胞間的接觸愈加頻繁，細胞團塊逐漸聚攏，最終變成致密的細胞球[13]。而采用黏附力較強的CM作為底物的培養體系中，MSCs成球原理則完全不同，CM上的MSCs運動活躍，細胞先在基底膜黏附并伸展，然后收起偽足聚集成團，細胞球體間也會發生再融合[12]。

研究表明CM底物誘導MSCs成球的一系列過程與CM釋放的鈣密切相關。實驗中觀察到CM上的MSCs球狀體細胞內的鈣水平顯著升高，證實了殼聚糖結合的鈣進入細胞，而減小CM的厚度以及加入EGTA（一種Ca2+螯合劑），發現MSCs球體的直徑減小，這可能是改變了鈣儲庫容量的結果[14]。因此，CM可能通過其表面結合的鈣轉移到MSCs中，影響細胞基質和細胞間的相互作用，從而對成球發揮作用。鈣黏蛋白在細胞間力傳導中發揮重要作用，研究證實CM上MSCs球體的N-鈣黏蛋白表達上調，其可能通過整合素相關通路調節以促進MSCs球體的產生；同時研究發現CM誘導的MSCs球體中各種鈣相關基因表達上調，證實了鈣信號在CM形成的MSCs球體中的關鍵作用，這在其他球體培養系統中尚未見報道[11]。此研究還在殼聚糖膜上發現與細胞黏附遷移有關的基因，如基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）。MMP是降解ECM的蛋白水解酶，在細胞遷移以及ECM蛋白和黏附分子的加工中起重要作用[15]。這些與CM上觀察到的MSCs高遷移率一致，而CM上的MSCs的活躍運動可能促進了MSCs球體的形成。盡管觀察到基因、蛋白質表達的一些變化，但是在CM誘導MSCs球體形成的確切機制還尚未闡明，而MSCs在CM上形成球體后的“3D效應”也是其生物學功能發生變化的重要基礎[12]。

3 CM培養MSCs的生物學功能改變

3.1 CM誘導的MSCs球體的干性基因表達

研究證實，轉錄因子Oct4、Sox2和Nanog對維持多能胚胎干細胞分化潛能至關重要[16]，這些干性標志物基因同樣存在于成體干細胞中[17]。通過基因分析證實了CM上MSCs球體的Oct4、Sox2和Nanog的表達水平較常規培養顯著上調，且在經過轉化生長因子-β3（transforming growth factor-βtype 3，TGF-β3）誘導后，殼聚糖膜上MSCs球狀體表現了更好的中軟骨細胞分化能力，有更高的糖胺聚糖及Ⅱ型膠原表達水平[18]；CM培養的MSCs細胞球體通過5-氮雜-2-脫氧胞苷誘導后，心臟標志物基因（Gata4、Nkx2.5、Tnnt2和Myh6）的表達水平較平板培養也顯著提高[14]。這些證實了CM成球培養對MSCs的干性維持及多向分化具有促進作用。

很多研究者認為干性基因的維持與球體形成現象高度相關，這在其他MSCs球體培養體系中也被證實[13]，與非黏附性材料聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）表面形成的球體對比發現CM誘導形成的MSCs球體更大，且有更高的干性基因表達水平[11]。這表明除了誘導MSCs形成細胞球體本身之外，MSCs與CM底物之間的相互作用對MSCs的干性維持也可能發揮了作用。

3.2 CM誘導的MSCs細胞球體的活力與移植活性

研究者通過臺盼蘭染料排斥實驗來評估單層和球體細胞中存活的MSCs的百分比，發現CM培養的MSCs球體與平板培養的MSCs，細胞活力均超過95%；為了評估球體細胞的增殖潛力，將MSCs球體用胰蛋白酶解離并接種回聚乙烯平板培養，與單層MSCs相比，球體衍生的MSCs在開始時表現出較慢的增長，但是在稍晚的時間點即開始出現較為活躍的增殖過程。在進一步的動物實驗中，將數量相同的CM底物誘導MSCs球體解離細胞和平板培養的細胞分別注射入裸鼠后肢中，CM組中檢測到了更高水平的抗人核抗原（human nuclear antigen，HNA）水平，MSCs薄膜誘導的球體MSCs表現出了更好的滯留作用及增殖潛力[19]。因此，若在移植前通過CM培養法移植治療前誘導MSCs形成球體，可能會顯著提升治療效果。

3.3 CM誘導的MSCs球體的黏附遷移趨化能力

研究發現CM的MSCs的基質金屬蛋白酶MMP家族基因表達上調，這與MSCs在CM上的高遷移率現象一致。此外還觀察到在殼聚糖上MSCs球體中控制細胞間黏附的多種基因上被上調，包括鈣黏蛋白、細胞黏附分子、Notch和肝配蛋白受體等，此類細胞黏附基因表達的增強可以使細胞在球體形成中更好地進行通訊及協調。相對平板培養，CM上MSCs球體細胞的趨化因子及其受體的上調尤其具有重要意義[11]，結果顯示編碼趨化因子樣受體1（chemokine like receptor 1，CMKLR1）的基因高表達（約50倍）。它同時也是chemerin受體23（Chemerin Receptor 23，ChemR23），而Chemerin/CMKLR1相互作用也被報道可促進脂肪形成和血管生成[20]；其他上調的趨化因子受體或配體包括趨化因子受體4和7（chemokine receptor type 4 andtype 7，CXCR4和CXCR7），它們是基質衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF1）的受體，而CXCR4是研究最多的趨化因子受體之一，在細胞遷移，增殖和分化中發揮重要作用[21]。而表達上調的單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）和MCP-3對MSCs來說則是重要的歸巢因素[11]。由于遷移趨化功能對MSCs的治療性能至關重要，CM誘導的MSCs球狀體的遷移和趨化性值得進一步深入研究。

3.4 CM培養的MSCs細胞球體的抗炎抗腫瘤作用

有研究表明，與平板培養相比，球體培養模式中對MSCs旁分泌具有增強作用，比如骨髓來源MSCs球體分泌的抗炎因子TNF-α刺激基因6（TNF-α stimulated gene 6，TSG-6）可在小鼠心肌梗死中有效減輕炎性反應[22]；白細胞介素24（Interleukin 24，IL-24）的分泌的增加能降低腫瘤細胞的活性[23]，而CM誘導的球體MSCs也被證實具有類似的生物學性能改變[11]。CM培養MSCs細胞球體中許多抗炎基因的表達水平上調，包括白細胞介素1受體拮抗劑（interleu-kin-1 receptor antagonist，IL1RN）、白細胞介素4誘導的蛋白1（Interleukin 4 induced protein 1，IL4I1）、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）等。腫瘤壞死因子超家族成員9（recombinant tumor necrosis factor receptor superfamily，member 9，TNFSF9）也被上調，其可通過CD137受體/配體系統介導免疫抑制和免疫刺激[24]。而上調的LIF、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）和轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）被認為是與MSCs的免疫調節性質有關的因子[25]。這類基因在移植物抗宿主病和自身免疫性疾病的臨床治療中發揮重要作用。

同時發現CM上MSCs有少量抗腫瘤基因上調。尤其是CM上MSCs觀察到高表達的IL-24基因。IL-24被認為是一種腫瘤抑制基因，可以選擇性地誘導癌細胞凋亡，而不影響正常細胞[26-27]。腫瘤蛋白p53（tumor protein 53，tp53）是另一種上調的腫瘤抑制基因，涉及多種關鍵的細胞功能，如增殖、細胞周期停滯、細胞凋亡和DNA修復機制[28]。這些結果表明CM培養促進了MSCs的分泌功能，在減輕炎癥及抗腫瘤方面具有廣闊的應用潛力。

4 CM誘導的MSCs球體生物學功能改變的潛在機制

4.1球體效應

類似其他三維細胞培養體系，CM形成的MSCs球體是個復雜的多細胞聚合體，這種“球體效應”無疑是MSCs生物活性變化的重要基礎。

首先，MSCs球體營造的輕度缺氧環境可能比正常培養條件下（21%O2）更接近MSCs的自然生長狀態（例如骨髓中的O2張力為1%～7%），MSCs可以從缺氧中受益，從而抑制衰老，增加增殖，并增強其間充質譜系的分化潛能[29-30]。其次，球體結構為MSCs細胞間接觸提供了更好的三維空間，通過緊密的聯系，促進細胞間物質信息交換能力。比如觀察到CM上MSCs球體的EphA7上調，其在軸突受體傳導通路中發揮重要作用，而此類細胞黏附基因的增強可在MSCs球體中提供更好的細胞通訊和協調功能，從而使MSCs球體更好的發揮生物學活性[11]。同時，CM上球體的形成，更大程度發揮了ECM對MSCs的支持作用。研究發現球體MSCs的ECM合成效率較貼壁培養模式顯著增強，ECM可通過細胞膜表面的整合蛋白將信號傳入細胞內，從而系統地調控細胞的生命活動[31]。而關于CM上MSCs的球體效應對MSCs 的影響仍然需要進一步的深入研究。

4.2 細胞底物相互作用

通過分析CM底物衍生的3D MSCs球體對2D培養的MSCs的基因表達譜，證實了諸多底物依賴性基因的參與誘導MSCs球體的產生并促進其生物活性，而這種細胞底物作用機制也是CM培養方式與其它3D培養體系的本質區別。鈣相關基因的特異性調節可能參與了CM上MSCs球體的產生，同時黏附遷移及抗炎抗腫瘤相關基因表達上調，這在上文中已經提到。通過CM與PVA分別誘導形成球體，結果發現CM上MSCs的相關基因表達上調較PVA更加明顯，CM的持續調節效應與PVA的瞬時上調表明了細胞-底物相互作用在MSCs基因調控中的重要性[11]。

4.3 自噬作用

自噬現象普遍存在于大部分真核細胞中，主要介導了損傷的蛋白質和細胞器的特異性降解，而自噬激活通常被認為是細胞存活的適應性和保護機制[32]。關于CM上培養對MSCs自噬方面的研究較少。

在既往研究中，提出CM誘導形成的MSCs球狀體中自噬增強的觀點。實驗中觀察到CM培養方法增強了MSCs的自噬反應，且自噬水平與球體形成的效率相關聯，Ca2+可能在CM底物衍生的MSCs球體的自噬誘導中發揮了積極作用。而MSCs球狀體中的增強的自噬不僅可以保護細胞形成應激，還可以防止細胞在體外擴增期間的早期衰老，從而使MSCs移植后具有更好的生存和治療效果[33]。而近期的一項研究提出了新的觀點，認為CM底物上MSCs球體中心的原始MSCs發生自噬活化，而附著于球體外周的晚期衰老細胞，發生自噬失活，進而被誘導凋亡，因此推測CM成球培養方式通過抑制自噬特異性誘導晚期衰老細胞凋亡以增強MSCs的干細胞特性[34]。

5 CM培養MSCs的臨床應用前景

5.1 組織修復領域的治療潛力

與傳統的MSCs注射療法相比，通過各種方式誘導形成的MSCs球體展現出了更好的治療效果，而通過CM誘導形成的MSCs 球體具有以下治療優勢：CM誘導形成的MSCs球體具有更強的多向分化潛能和遷移趨化能力，移植后可更高效的定向分化，修復受損組織；“球體效應”營造的低氧等環境使MSCs的適應能力加強，并加強了抗炎抗腫瘤等活性因子的釋放；CM培養方法較其他成球培養方式技術要求簡單，易于大規模推廣。基于以上優勢，若在移植前通過CM培養對MSCs進行預處理，可有效增強MSCs的生物活性，更好地發揮其修復組織的效果。

5.2 分選原始MSCs的應用潛力

MSCs是異質性細胞群體，連續的傳代培養可能造成其不同程度的衰老，而維持干細胞特性對MSCs的治療作用至關重要。CM上MSCs細胞球體干性基因表達水平的上調可能歸因于從異質群體中分選出了更為原始的MSCs。

此前有研究發現，異質性牙齦纖維細胞在CM培養后形成的細胞球體較其他細胞具有更高的干性基因的表達水平，實質上從異質的細胞集團中篩選到更具干性的更具多向分化潛能的MSCs亞群，推測其與鈣黏蛋白的高表達有關[35]。近期的研究結果認為，CM培養MSCs特異性地激活衰老細胞中mTORC1途徑以滅活自噬，誘導其凋亡，從而選擇更具分化潛能的MSCs。CM培養過程中，MSCs起初3 d發生了顯著的細胞凋亡，MSCs球體中外圍細胞出現死亡，并且與早期傳代相比，晚期傳代的細胞球體外圍出現更高的凋亡細胞比例，表明其誘導凋亡對衰老細胞具有特異性[35]。這可能解釋了CM培養MSCs球體具有更高的干性基因表達水平的原因，一定程度展現出CM培養在分選高效MSCs用于再生醫學的可行性。

6 小結

綜上所述，CM培養方式誘導形成的MSCs球體較傳統貼壁培養的MSCs在干性維持、旁分泌效應及遷移趨化等生物活性方面均有顯著提升，這為臨床上提高MSCs細胞療法的效果提供了新思路。目前，關于CM成球培養增強MSCs生物活性的機制以及相關信號通路有一定了解，但還有大量問題需要進一步深入研究。比如，CM培養模式下誘導MSCs 聚集成球及生活學功能改變的具體機制；探討CM成球培養分選原始MSCs的可行性；CM培養方式下如何獲得大量均勻、適當粒徑的MSCs球體，既達到促進細胞生物活性而不至于導致中央區細胞缺氧壞死。揭開這些問題有助于進一步了解CM誘導MSCs球體的理化性質，建立更加穩定的CM成球培養體系，從而推動MSCs的臨床應用。