HOXB3在結直腸癌中的表達及其臨床意義

林秀欣 劉森觀 周穎 余更生 周偉

1江門市中心醫院腫瘤科（廣東江門 529030）；2遵義醫學院附屬第五醫院急診科（廣東珠海 519170）

結腸癌是我國胃腸道系統中較常見腫瘤之一，位居我國腫瘤發病率第5位，但其病死率卻僅次于肺癌位居第二位，且隨著人們生活節奏的加快和飲食結構的變化，其發病率有逐年上升趨勢，嚴重危害了我國居民身體健康［1-3］。早期結直腸癌患者的預后很好，晚期結直腸癌患者預后明顯變差。多項研究顯示，疾病的早期診斷及準確評估預后，對腫瘤患者的生存期延長具有重要意義［4-5］。近年來，隨著基因檢測技術的進步，結直腸癌的K?ras、BRAF、MSI、MMR等生物標記物的研究進展在腫瘤治療取得很大的進展，但是這些標志物在臨床實踐中的指導意義仍十分有限。因此，尋找與結直腸癌的診斷和進展相關的新生物標志物，對鑒別高風險患者可能受益于更積極的臨床干預具有重要價值。HOXB3是HOXB家族成員，該基因家族參與胚胎發生發育過程，調控細胞分化和增殖。最近文獻報道，HOXB3在乳腺癌的內分泌治療耐藥、白血病細胞的分化及卵巢癌減瘤術后的復發有關［4-6］，表明HOXB3在多種腫瘤的發生發展中扮演重要角色。但是，HOXB3在結直腸癌中的表達及臨床病理意義未見相關報道。本研究通過免疫組織化學的方法檢測結直腸癌患者組織中的HOXB3的表達，發現HOXB3在結直腸癌中也高表達，進一步分析發現，HOXB3與結直腸患者的不良臨床病理因素相關，高表達HOXB3的患者預后也更差。因此筆者推測HOXB3有可能作為結直腸癌的一個腫瘤標志物，有助于該病的早期發現和治療。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料以2012年1月至2013年8月209例結直腸癌患者手術切除結直腸癌組織為研究對象，男113例，女96例；年齡28～64歲，平均（48.9±5.3）歲；患者術前沒有進行任何方式治療。同時，本實驗用了分別來自4個結直腸癌患者的成對的正常腸黏膜組織、結直腸癌組織、肺轉移組織及肝轉移組織。

1.2 方法采集患者相應標本后部分置于液氮中保存，部分使用4%多聚甲醛固定，進行免疫組化和病理分析。采用免疫組織化學方法（IHC）對比患者正常結直腸黏膜組織、癌旁組織及腫瘤組織、轉移灶組織中HOXB3表達水平及臨床病理特征。具體步驟為：（1）組織固定后，制作石蠟切片；（2）將切片進行脫蠟水化；（3）微波爐內6 min×4次對切片進行抗原修復；（4）切片溫度降至室溫后，使用PBS沖洗5 min×3次；（5）使用二抗試劑盒封閉內源性過氧化氫酶；（5）孵育一抗4℃過夜；（6）使用PBS沖洗5 min×3次后，室溫孵育二抗；（7）PBS清洗后，DAB顯色，鏡下觀察，適度反應后終止；（8）蘇木精復染后，脫水，封片。鏡下觀察，棕黃色部分為陽性，在胞質中表達；只有藍色的核，無黃色胞質的為陰性。

1.3 觀察指標免疫組化結果顯示HOXB3蛋白表達主要位于細胞漿內，陽性信號表現為棕黃色或棕褐色顆粒。根據陽性染色強弱程度積分，胞漿呈現淡黃色為1級；胞漿呈現棕黃色為2級，胞漿呈現棕色為3級。根據顯微鏡低倍鏡觀察陽性細胞計數，包括4個等級，0～10%為1級；10%～25%為2級；25%～50%為3級；50%～100%為4級。同樣細胞的陽性表達濃度也包括4個等級，陰性表達為0級。將二者相乘，得分為0～12分，根據所有患者評分的中位數為界，0～4分表示低表達，大于等于6分表示高表達。以上判讀結果由兩位經驗豐富的副主任級別以上病理醫生共同決定。

1.4 統計學方法應用統計學軟件SPSS20.0對數據進行分析，計數資料以構成比表示，組間比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率。生存分析采用Kaplan Meier方法。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HOXB3在不同結直腸癌患者正常腸黏膜組織、腫瘤組織、轉移灶組織中免疫組化情況首先檢測了4例患者正常黏膜、腫瘤組織、肝肺轉移灶。如圖1所示，免疫組化檢測結果顯示其中一例患者的正常黏膜組織中幾乎檢測不到HOXB3的表達，但是在相應的來自同一患者的腫瘤組織中HOXB3的表達明顯升高，免疫組化結果見到腫瘤組織中染色呈棕色到棕褐色。同樣地，在相應的肺組織，肝組織的轉移灶中HOXB3的表達也是高表達。

圖1 HOXB3在結直腸組織、轉移組織中的免疫組化結果Fig.1 HOXB3 expression in paired normal colorectal mucus，cancerous tissues and metastasis sites from 4 colorectal cancer patients

2.2 HOXB3表達水平相關因素分析進一步，本研究擴大樣本量，在209個結直腸癌患者的腫瘤組織樣品中檢測HOXB3蛋白的表達水平。分析結果顯示有108例（51.7%）患者HOXB3蛋白低表達，101例（48.3%）檢測到強陽性高表達HOXB3蛋白。進一步相關性分析表明，HOXB3表達水平與與結直腸癌患者的臨床分期（P＜0.001）、T分期（P＜0.001）、N分期（P＜0.001）顯著相關，與患者性別、年齡無明顯相關性，見表1。表明HOXB3的表達隨著臨床分期增加而表達上調，HOXB3可能與結直腸癌的臨床發展相關。

2.3 HOXB3表達水平與結直腸組織病理特征關系如圖2所示，不同臨床分期的結直腸患者的HOXB3蛋白表達的免疫組化評分（材料方法中已詳細說明）均值，如圖所示，隨著臨床分期增加，HOXB3的表達評分升高。

2.4 HOXB3表達水平與患者生存關系Kaplan?Meier生存分析顯示HOXB3高表達的結直腸癌患者的預后較HOXB3低表達的患者差（P＜0.05）。見圖3。

表1 HOXB3表達水平相關因素分析Tab.1 Analysis of factors related to HOXB3 expression例（%）

圖2 結直腸黏膜及不同臨床分期結直腸癌患者組織中HOXB3蛋白表達的評分Fig.2 IHCscores of HOXB3 protein expression in normal colorectal mucus and different clinical stages

圖3 HOXB3表達水平與患者生存關系Fig.3 HOXB3 expression and survival of colorectal cancer patients

3 討論

結直腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一，也是嚴重危害人民健康的惡性腫瘤。關于其發病機制目前尚未完全闡明。結直腸癌的預后不佳與疾病發現的時間密切相關，早期發現疾病，早期治療對患者的恢復十分重要［1-2］。

HOX基因家族在果蠅發育調控的相關研究中被發現并報道，后續的研究報道其在生物進化過程中具有保守型，HOXB3是HOX家族成員之一，它含有一段180個左右核苷酸的同源異形盒DNA結構，該段基因能夠編碼60個氨基酸殘基［8］。同源盒基因編碼的蛋白質是轉錄因子，對胚胎發育具有重要作用。對生物個體發育、形態發生、器官塑形等起到調控作用［9］。有報道顯示，在正常早期造血干細胞有HOX基因表達，而發育成熟造血細胞HOX基因表達下調，其表達異常可導致白血病的發生。HOXB3對細胞的增殖與分化級遷移等具有促進作用，同時它也參與了生理與病理狀態下血管的生成過程，比如，腫瘤的血管生成，淋巴管生成，內皮增生等［3-4］。文獻報道，HOXB3對前列腺癌、胰腺癌及乳腺癌中表達增高，對腫瘤的發生及進展具有重要作用［11-15］。

本研究首次通過免疫組化的方法發現結直腸癌組織中HOXB3的蛋白表達水平明顯高于來自同一患者的正常組織。進一步分析發現HOXB3高表達與結直腸癌患者的臨床病理特征顯著相關，這對臨床結直腸癌患者的治療具有重要作用，給臨床提供了一定的理論依據。HOXB3表達較高者生存時間更短，這說明HOXB3表達較高患者預后較差，可以作為患者預后的一個評價指標。但是，本研究中由于病例數限制及技術有限，本研究結果可能存在一定偏差，需要進一步在更大樣本量的研究中進一步驗證。

綜上所述，HOXB3的高表達與結直腸癌的發生、發展、轉移及預后密切相關，可能是一個潛在的新的直腸癌的預后指標，HOXB3在結直腸癌的發生發展中的重要生物學功能和可能的分子機制功能需要進一步研究。