超聲介導載miR?34a脂質(zhì)微泡對宮頸癌抑制作用的體內(nèi)實驗研究

馬瑤 劉朝奇 鄭智唯 姜矜君 趙云

1三峽大學醫(yī)學院（湖北宜昌 443002）；2腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室（湖北宜昌 443002）

MicroRNA（miRNA）是一類非編碼小分子RNA，在腫瘤的早期診斷、病情監(jiān)測、預后評估等方面已獲得許多成果［1］，WANG等［2］研究發(fā)現(xiàn)感染HPV16的宮頸癌中miR?34a低表達，提示miR?34a在腫瘤中可能有抑癌因子樣作用，有望成為宮頸癌基因治療的靶點。近年來，隨著超聲微泡造影技術(shù)的發(fā)展，不僅將微泡造影劑用于成像，還可以作為基因或藥物的載體，在超聲輻照下，達到定位釋放、靶向治療的目的［3］。基于以上研究成果，本實驗著重探討了超聲介導載miR?34a脂質(zhì)微泡對小鼠U14皮下移植瘤的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器二硬脂酰磷脂酰膽堿（DSPC）、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE?PEG 2000）、聚醚酰亞胺（PEI?600）、全氟丙烷氣體（C3F8）、氮氣、超聲波清洗儀（SONICS）、渦旋器、掃描電鏡（JSM?7500F）、馬爾激光粒度儀（Nano?ZS90型）、超聲治療儀（UGT1025）、血球計數(shù)板、微量核酸蛋白檢測儀（Thermo scientific）、組織研磨器（TIANGEN?OSEY50）、實時熒光定量 PCR 儀（Applied Biosystems，Step One Plus）。

1.2 載miR?34a陽離子脂質(zhì)微泡的制備取事先配好的DSPC、DSPE?PEG2000、PEI?600混于玻璃試管中，55～60℃水浴鍋預熱后，渦旋狀態(tài)下充入氮氣使液體成膜，抽真空3 h除盡殘余氯仿，加入配好的Tris緩沖液，于超聲波清洗機內(nèi)清洗至溶液清亮，分裝至西林瓶，加蓋密封，抽真空后充入C3F8置換，最后將西林瓶高頻振蕩即得到陽離子脂質(zhì)微泡。血球計數(shù)板計數(shù)，并計算其濃度，粒度儀測量粒徑，掃描電鏡觀察微泡形態(tài)。通過不同濃度陽離子微泡和miR?34a孵育后進行DNA瓊脂糖凝膠電泳的實驗，測試出二者最佳孵育比例，每次處理小鼠前，按每1μg質(zhì)粒與107～108個的微泡的比例共同孵育miR?34a和陽離子脂質(zhì)微泡30 min，得到載miR?34a陽離子脂質(zhì)微泡。

1.3 實驗動物及瘤株SPF級BALB/c小鼠25只，雌性，18 g左右，由三峽大學動物實驗中心提供。U14宮頸癌細胞瘤株，由三峽大學腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室提供。

1.4 小鼠U14皮下移植瘤模型建立從荷U14宮頸癌細胞的小鼠腹腔內(nèi)抽取腹水，調(diào)整細胞濃度約2×107/mL于小鼠右前腋皮下接種0.2 mL，1周后形成約0.5cm皮下腫瘤結(jié)節(jié)。

1.5 動物分組及處理成功建立18只小鼠U14宮頸癌皮下移植瘤模型，隨機分為3組：對照組（Control group）、空陽離子脂質(zhì)微泡組（Empty cat?ionic lipid microbubbles group，Empty?CMB）、載miR?34a陽離子脂質(zhì)微泡組（MiR?34a?loaded cationic lipid microbubbles group，MiR?34a?loaded?CMB），根據(jù)分組給予不同種類微泡制劑的注射，其中對照組給予相同劑量的生理鹽水處理，每2天經(jīng)尾靜脈注射（0.2 mL/只）及超聲輻照瘤體一次，輻照條件：頻率1 MHz，功率1 W/cm2，占空比50%，輻照時間90s/只，并于治療前測量瘤體長徑（a）、短徑（b），按公式V=1/2ab2計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。治療5次后處死小鼠，剝離瘤體，計算腫瘤體積及抑瘤率。

1.6 樣本采集及相關(guān)檢測將部分腫瘤組織于-80℃保存，組織研磨器（TIANGEN?OSEY50）研磨組織后，使用Trizol試劑（TaKaRa）按照說明書提取總RNA，使用PrimeScriptTMRT試劑盒（TaKaRa）將1～5μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過實時熒光定量PCR（RT?PCR）按 10 μL每孔的反應(yīng)體系加樣，包括5μL SYBR GreenⅠ（Takara），2.5μL無菌水，上下游引物各0.25μL，2μL模板cDNA，擴增反應(yīng)程序為95℃預變性20 s；95℃變性3 s，60℃退火30 s，40個循環(huán)，每個樣品重復3次，實驗數(shù)據(jù)采用相對定量法法分析。檢測腫瘤組織中miR?34a、c?met、bax表達情況。剩余組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，脫水、石蠟包埋，4μm切片，免疫組織化學法檢測各組腫瘤組織中c?Met、Bax的蛋白表達情況。

1.7 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果用均數(shù)±標準差表示，各組之間的比較使用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 脂質(zhì)微泡形態(tài)及一般性質(zhì)制備的脂質(zhì)微泡為乳白色懸液，鏡下呈球形（圖1），分散均勻，平均粒徑為（1.2±0.24）μm，平均濃度為6.4×109個/mL，調(diào)整濃度為1×109個/mL用于實驗。

圖1 脂質(zhì)微泡形態(tài)圖Fig.1 Lipid microbubbles′morphology under the microscope

2.2 陽離子脂質(zhì)微泡與miR?34a的結(jié)合情況相同體積不同濃度陽離子微泡（CMBs）分別與等量的miR?34a孵育，DNA瓊脂糖凝膠電泳實驗結(jié)果顯示，適量的CMBs與miR?34a結(jié)合性較好，可防止更多的DNA向正極移動（圖2）。

圖2 陽離子微泡的基因攜載能力Fig.2 DNA?binding ability of cationic microbubbles

2.3 各組腫瘤生長情況對照組、空微泡組腫瘤不同程度持續(xù)增大，部分小鼠患肢出現(xiàn)功能障礙，治療后載miR?34a陽離子脂質(zhì)微泡組腫瘤生長較其他兩組緩慢，各組腫瘤生長曲線（圖3），各組腫瘤體積及抑瘤率（表1），載miR?34a陽離子脂質(zhì)微泡組腫瘤平均體積明顯小于其他兩組。

圖3 各實驗組小鼠腫瘤生長曲線Fig.3 Tumor growth curves in each experimental group of mice

表1 各實驗組小鼠腫瘤抑瘤率對比Tab.1 Comparison of tumor inhibition rates among mice in experimental groups± s

表1 各實驗組小鼠腫瘤抑瘤率對比Tab.1 Comparison of tumor inhibition rates among mice in experimental groups± s

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別對照組空微泡組載miR?34a微泡組腫瘤體積（mm3）822.11±115.95 759.37±66.67 357.89±89.59體積抑瘤率（%）0 7.63 56.47*

2.4 實時熒光定量PCR結(jié)果各組腫瘤組織miR?34a的表達比較：載miR?34a陽離子脂質(zhì)微泡組的miR?34a表達較其他兩組明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖4）。各組腫瘤組織c?met基因及bax基因表達比較：載miR?34a陽離子脂質(zhì)微泡組c?met表達較其他小組下調(diào)，bax表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖4）。

圖4 各實驗組小鼠腫瘤組織相關(guān)基因表達量比較Fig.4 Comparison of expression levels of related gene in experimental mice

2.5 腫瘤組織免疫組織化學檢測結(jié)果各組腫瘤組織c?Met及Bax蛋白表達比較：相對于對照組及空微泡組，載miR?34a陽離子脂質(zhì)微泡組c?Met表達較低，Bax表達增高（圖5）。

3 討論

大量研究表明miRNA在腫瘤組織中表達存在差異性，因此不少學者認為其表達失控可促進腫瘤發(fā)生發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)miR?34a可通過調(diào)控多種靶分子參與腫瘤細胞的增殖與凋亡［4］，可能作為腫瘤抑制因子抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展。成功的基因治療主要取決于安全有效的傳遞系統(tǒng)［5］，目前常用的病毒載體雖然轉(zhuǎn)染率高，但其在體內(nèi)的安全性問題一直備受爭議，而裸質(zhì)粒等非病毒載體又存在靶向性差，轉(zhuǎn)染率低等諸多問題［6］。因此尋求非病毒、非侵入性、靶向基因遞送方式十分重要。陽離子超聲微泡作為一種新型非病毒載體，可通過電荷相互作用攜帶具有陰離子磷酸骨架的DNA［7-8］，聯(lián)合超聲輻照，產(chǎn)生空化效應(yīng)、聲孔效應(yīng)等增加了基因轉(zhuǎn)染，克服了病毒載體存在的靶向性差、安全性低、免疫原性高等缺陷，可安全、有效增強基因轉(zhuǎn)染［9-10］。GUO等［11］通過超聲微泡介導的反義miRNA?224和miRNA?122a質(zhì)粒轉(zhuǎn)染非小細胞肺癌A549細胞，結(jié)果顯示具有良好的轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染后的細胞生長，侵襲和集落形成能力均受到抑制，與對照組相比差異有顯著性（P＜0.05）；過新民等［12］利用超聲微泡介導了miR?199a對人肝癌細胞HepG2細胞的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率達（26.31±0.72）%。

本實驗以陽離子超聲微泡為媒介，通過靜電吸附，攜載基因，外源性引入miR?34a到腫瘤組織中，探討了超聲介導下載miR?34a脂質(zhì)微泡對小鼠U14宮頸癌皮下移植瘤的抑制作用。通過繪制腫瘤生長曲線，計算抑瘤率，檢測相關(guān)基因及蛋白表達等方面，評估不同組別的抑瘤效果。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示載miR?34a陽離子脂質(zhì)微泡組的miR?34a表達上調(diào)，說明我們通過載基因陽離子脂質(zhì)微泡聯(lián)合超聲定位輻照成功地將miR?34a引入靶組織，JI等［13］也成功地利用微泡聯(lián)合超聲輻照介導了miR?133a對乳腺癌移植瘤的轉(zhuǎn)染，這種有效并無創(chuàng)的轉(zhuǎn)染是微泡經(jīng)過血液循環(huán)，到達腫瘤組織，在超聲定位輻照下，產(chǎn)生的空化效應(yīng)及聲孔效應(yīng)等生物學反應(yīng)，造成細胞膜損傷及膜通透性的改變，從而促進了基因的有效運輸。有研究［14］報道m(xù)iR?34a以堿基互補配對的方式與靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物部分或者完全互補，導致轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被剪切或翻譯抑制，從而抑制細胞增殖，促進凋亡，本實驗各組小鼠腫瘤生長情況顯示，載miR?34a陽離子脂質(zhì)微泡組的腫瘤生長明顯較緩，這可能與我們外源性引入miR?34a相關(guān)，調(diào)節(jié)miR?34a在腫瘤組織中的表達后，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制了靶基因的翻譯，從而減緩并抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

圖5 各實驗組小鼠腫瘤組織相關(guān)蛋白表達量比較Fig.5 Comparison of expression levels of related proteins in experimental mice

為了了解外源性引入miR?34a表達后，具體是通過哪些途徑來達到腫瘤抑制效果的，我們通過免疫組化及實時熒光定量PCR實驗技術(shù)檢測了腫瘤組織中相關(guān)蛋白及基因的表達，結(jié)果顯示載miR?34a陽離子脂質(zhì)微泡組Bax表達上調(diào)，c?Met表達下調(diào)；Bax是人體最主要的凋亡蛋白之一，其過度表達可拮抗Bcl?2的保護效應(yīng)，使細胞趨于死亡［15］，在LIN 等［16］的研究中顯示bcl?2基因的3′非翻譯區(qū)存在潛在miR?34a結(jié)合位點，說明miR?34a極有可能通過調(diào)控Bcl?2/Bax信號通路，來促進腫瘤細胞的凋亡；受體酪氨酸激酶c?Met是一種由c?met原癌基因編碼的蛋白產(chǎn)物，為肝細胞生長因子受體，在多種惡性腫瘤中異常表達，與腫瘤細胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系［17］，BEZAWY等［18］研究表明miR?34a可通過下調(diào)c?Met來達到抗腫瘤作用；也就是說利用微泡聯(lián)合超聲輻照引入miR?34a在腫瘤組織中高表達后，可能通過調(diào)控Bcl?2/Bax信號通路，下調(diào)c?Met表達來達到一定的治療效果。當然還可能存在其他的抑制途徑及更詳細的調(diào)控機制需要后期實驗來進一步驗證。

綜上所述，本實驗成功制備了載miR?34a陽離子脂質(zhì)微泡，利用超聲定位輻照，作用于小鼠U14皮下移植瘤，介導了miR?34a對腫瘤組織的轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示載miR?34a陽離子脂質(zhì)微泡能有效抑制腫瘤生長，促進腫瘤細胞凋亡，為腫瘤的基因治療提供了新思路。但這種非侵入性基因轉(zhuǎn)染治療腫瘤的效率及安全性的提高還需要后期大量實驗來探索與驗證。