IFN?γ通過下調PD?1和PD?L2信號通路拮抗CD33來干預肺結核發展的機制

張艷麗 楊衛 武麗 李福建 張貴賢

1保定市傳染病醫院結核科（河北保定 071000）；2保定市第一中心醫院呼吸科（河北保定 071000）

結核病（tuberculosis，TB）每年導致860萬新病例和170萬人死亡［1］。表達IFN?γ的Th1細胞和產生IL?17的Th17細胞在控制結核感染中起關鍵作用。最近，髓系來源的抑制性細胞（MDSC）與T細胞反應的不平衡相關并參與TB的疾病進展。MDSC具有抑制T細胞應答的強大能力。MDSCs可分為兩類：顯示CD14?CD15+CD11b+CD33+HLA?DRlow/-表型的粒細胞MDSCs和具有CD14+CD15?CD11b+CD33+HLA?DRlow/-表達的單核細胞MDSCs［2］。高度抑制的MDSC通過細胞—細胞相互作用發揮其功能，包括共刺激/抑制分子如B7?H1（PD?L1）、B7?H3［3］、CD40和CD80。在IFN?γ存在的情況下通過GM?csf和IL?6體外產生人CD33+MDSC可用作鑒定IFN?γ的功能。

1 對象與方法

1.1 研究對象活動性肺結核（LTBI）患者120例，LTBI患者80例，健康體檢者40例。所有參與者都是成年人，不包括孕婦和兒童。肺結核的診斷基于陽性痰涂片和（或）培養結果和胸片。對于細菌培養結果陰性的患者，通過胸片、臨床癥狀確診，經抗結核化療后癥狀改善和影像學改善。健康人從本院進行健康體檢隨機抽取。健康個體篩選標準：（1）無發熱，咳嗽或其他活動性結核體征；（2）體格檢查結果正常，X線正常；（3）TST檢查，T?SPOT陰性。排除標準：惡性腫瘤，HIV感染或攝入免疫抑制劑的個體。

1.2 體外產生人類MDSC通過聚蔗糖梯度離心從健康個體分離PBMC，并在含有10%FBS（Sigma Aldrich，Munich，Germany），2 mmol谷氨酰胺，100 IU/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的RPMI?1640培養基。為了產生功能性MDSC，在重組人細胞因子GM?csf，IL?6（10 ng/mL）和 IFN?γ（10 ng/mL）（R&D Systems，Minneapolis，MN，USA）的存在下，在完全培養基中以5×105個細胞/mL在T?25燒瓶中培養PBMC 7 d。用單獨培養基和單核細胞培養的PBMC［通過磁性活化細胞分選抗CD14微珠（BD Pharmingen）分離］用作對照。培養操作重復運行。培養基和細胞因子每3天進行一次。1周后，收集所有細胞并除去貼壁細胞。通過FACSAria細胞分選儀（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）分離CD33+或CD33+HLA?DR+/-細胞。

在BD LSRFortessa流式細胞儀（BD Bioscienc?es，Franklin Lakes，NJ，USA）上測量細胞并使用Facs Diva軟件（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）進行分析。使用FlowJo軟件（Tree Star Inc，Ash?land，OR，USA）進行數據分析。通過流式細胞術發現分離的細胞群的純度為90%。

1.3 流式細胞儀為了表面染色，收獲PBMC，洗滌并用熒光綴合的mAbs或同種型匹配的對照的混合物在冰上染色30 min。MDSC的表型通過CD11b（ICRF44），CD33（WM53），HLA?DR（G46?6），CD14（MφP9），CD15（W6D3），CD80（BB1），CD86（2331），PD?L1（MIH1）和PD?L2（MIH18）的表達來評估。通過CD4（RPA?T4），CD8（RPA?T8），HLA?DR（L243），CD25（M?A251）和 CD69（FN50）（均來自BDPharmingen）來評估T細胞的表面表達。對于細胞內染色，在brefeldin A（eBioscience）存在下用佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯（PMA）和伊屋諾霉素（Invitrogen，Carlsbad，CA）模擬細胞4 h，然后收獲。表面染色后，將細胞固定，透化并用IFN?γ（B27），Foxp3（236A/E7）和相應的同種型對照（BD Pharmingen）染色。用膜聯蛋白V（BD Pharmingen）和PI（BD Pharmingen）染色檢測細胞活力和細胞死亡。在流式細胞儀（BD LSRFortessa）（BD Biosci?ences）上通過流式細胞術分析細胞表型。數據是作為活細胞門內設置的50 000個事件中標記細胞的分數獲得的，并使用FlowJo軟件（Tree Star）進行分析。

1.4 T細胞抑制測定分選CD33+或CD33+HLA?DR+/-細胞的抑制功能通過在下列抑制測定中抑制自體T細胞增殖的能力來測定。通過抗-CD3微珠和磁性柱分離（Miltenyi Biotec）從PBMC分離的T細胞被CFSE標記（5 μmol/L，Sigma?Aldrich），并以1×105個細胞/孔接種在96孔平板中。先前從細胞因子誘導培養系統分離的CD33+或CD33+HLA?DR+/-與CD3+T細胞以1∶4，2∶4和4∶4的比率共培養。通過抗CD3/CD28（1 μg/mL）和IL?2（50 U/mL；R＆D Systems）誘導T細胞增殖。3 d后分析CD4+或CD8+T細胞的增殖。對于所指出的研究，將FACS分選的抑制細胞與T細胞在下列抑制劑存在下共培養：10 mmol/L NG?單甲基-L-精氨酸（L?NMMA），100 μmol/L N?羥基-正-L-精氨酸（NOHA）（Sigma?Aldrich）和 10 μg/mL抗 PD?1和IgG對照（R&D Systems）。以15 000個事件的活淋巴門控細胞的增殖百分比獲得數據。

1.5 T細胞的增殖原代CD4+T細胞（CD4+CD45RO?CD62LhiCD25?）由 PBMC 陰性選擇磁珠（BD Pharmingen）純化，分離的T細胞群的純度為95%。在Th1或Treg傾斜條件下，在96孔U形底板中以1×105個細胞/mL切下初始CD4+T細胞。Th1 條件：在 IL?12（10 ng/mL）和 IFN?γ（10 ng/mL）存在下用平板結合的抗CD3（4μg/mL），抗CD28（1μg/mL）刺激初始T細胞。5 d后，用重組IL?2（50 U/mL）（BD Pharmingen）補充培養物。Treg條件：在TGF?β（5 ng/mL）和IL?2（10 ng/mL），抗IFN?γ（10μg/mL）和抗IL?4（10μg/mL）存在下，用平板結合的抗-CD3（4 μg/mL），抗-CD28（1 μg/mL）刺激初始T細胞。培養基每3天添加一次細胞因子和中和抗體。第7天，在IL?2（10 ng/mL）存在下收獲細胞，洗滌，計數并與先前分離的CD33+HLA?DR+細胞以1∶1的比率共培養。第12天，分析細胞的IFN?γ產生和FoxP3表達。

1.6 Transwell分析從細胞因子誘導培養系統分離的CD33+HLA?DR+/-細胞在抗CD3/CD28（1 μg/mL）和IL?2（10 ng/mL）存在下與自體CFSE標記的CD3+T細胞以1∶2的比率共培養3 d。當將CD3+T細胞置于上Transwell室（Costar?Corning，Amsterdam，The Netherlands）時，將 CD33+HLA?DR+/-細胞置于下Transwell室中。

1.7 一氧化氮（NO）按照制造商的方案（Promega，Madison，WI）測量血漿中的NO含量。將等體積的上清液（50μL）與Greiss試劑A和B混合，并在室溫下避光孵育10 min。使用酶標儀（Bio?Rad，Hercules，CA）測量550 nm處的吸光度。通過比較測試樣品的吸光度值與通過連續稀釋0.25 mmol/L亞硝酸鈉產生的標準曲線來確定亞硝酸鹽濃度。

1.8 精氨酸酶活性測定在來自分離的CD33+HLA?DR+細胞的細胞裂解物中測量精氨酸酶的活性［33］。簡而言之，將細胞用0.1%Triton X?100裂解30 min，隨后加入25 mmol/L TrisHCl。通過在56℃加熱10 min使酶活化。通過將裂解物與0.5 M L-精氨酸和10 mmol/L MnCl2在37℃孵育120 min進行精氨酸水解。加入α-異亞硝基苯丙酮（溶于100%乙醇）后，在95℃加熱30 min，用酶標儀（Bio?Rad）在540 nm處測量尿素濃度。基于連續稀釋的尿素標準曲線計算尿素含量（以上使用的藥劑均來自德國慕尼黑的西格瑪奧德里奇公司）。

1.9 統計學方法分別使用GraphPad Prismversion 5.0和SPSS Statistics 17.0，通過單因素方差分析（ANOVA）和Kruskal?Wallis檢驗評估臨床患者中MDSC水平的變化。如果發現顯著差異，則進行學生t檢驗以分析組之間的差異。使用Spearman秩和檢驗分析不同參數之間的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結核病患者外周血單核細胞MDSCs水平升高與HC相比，在TB患者中清楚地觀察到HLA?DR-/lowCD11b+CD33+MDSCs的顯著更高的群體。MDSCs主要是CD14陽性而不是CD15陽性。LTBI患者的MDSCs水平顯著高于HC患者，未經治療的活動性結核病患者的MDSCs水平高于LTBI患者，接受抗結核治療的結核病患者中MDSCs的頻率顯著降低。見圖1。

圖1 MDSCs在結核病患者中的擴展Fig.1 The expansion of MDSCs in tuberculosis patients

2.2 MDSC頻率與Th1的百分比呈負相關在HC中檢測到較低水平的IFN?γ或產生IL?17的CD4+T細胞。同時，在M.tb肽刺激后MDSCs的百分比顯著降低。MDSCs百分比與結核病患者Th1頻率成反比。見圖2。

2.3 GM?csf和IL?6誘導的CD33+HLA?DRlow細胞抑制T細胞增殖功能性CD33+MDSC樣細胞是HLA?DR+細胞而不是 HLA?DR?細胞。當與 HLA?DR高單核細胞比較時，CD33+HLA?DR+MDSC樣細胞幾乎是HLA?DR低表型。與配對的CD33+HLA?DR細胞相比，GM?csf和IL?6誘導的CD33+HLA?DRlow細胞能夠以劑量依賴的方式抑制自體T細胞的增殖。見圖3。

2.4 IFN?γ受體CD33+HLA?DRlow MDSCs表現出抑制功能下降GM?csf和IL?6誘導的CD33+HLA?DRlowMDSC與相應的IFN?γ受體化的MDSC相比，具有更強的抑制自體T細胞的能力。而CD33+HLA?DR-細胞顯示非抑制活性。與細胞因子誘導的CD33+HLA?DRlowMDSC共培養后，分析自體CD3+T細胞上CD69，CD25和HLA?DR的活化標志物的表達。IFN?γ-培養的CD33+HLA?DRlowMDSC抑制T細胞活化程度較低，而GM?csf和IL?6誘導的CD33+HLA?DRlowMDSC顯著抑制自體T細胞的活化。見圖4。

圖2 MDSC頻率與Th1在TB患者中呈負相關Fig.2 MDSCfrequency was negatively correlated with Th1 in TBpatients

圖3 IFN?γ教育抑制CD33+HLA?DRlow MDSC抑制T細胞增殖Fig.3 IFN?γ educate inhibition CD33+HLA?DRlow MDSCinhibition of T cell proliferation

細胞內流式細胞術分析表明，受IFN?γ培養的CD33+HLADRlowMDSC在較小程度上阻礙產生IFN?γ的 CD4+T，而 GM?csf和 IL?6誘導的 CD33+HLA?DRlowMDSC顯著抑制CD4+T細胞中的IFN?γ產生。此外，GM?csf和IL?6誘導的CD33+HLA?DRlowMDSCs與IFN?γ?受體相比誘導更高水平的FoxP3+CD4+T細胞。

3 討論

MDSCs與人類結核感染的進展密切相關，MD?SCs在活動性結核病患者以及LTBI患者的外周血中均有擴增［4-6］。此外，藥物治療減少了MDSC的積累。有證據表明MDSCs可以作為結核病治療反應的標志物。有趣的是，最近接觸結核病的結核菌素皮試（TST）（+）個體中MDSC的頻率高于遠程接觸結核病。活動性結核病患者的MDSC比具有LTBI的患者具有更廣泛的抑制作用。MDSCs的蓄積和功能與病原菌的加載或炎癥微環境有關。MDSC功能與病原體負載無關，盡管它們能夠攝取M.tb。鑒于MDSCs有較高可塑性，筆者設想在M.tb慢性炎癥過程中微環境中的免疫介質可影響MDSCs的積累和功能。具有潛伏感染的個體通常獲得有效的T細胞應答保護，而患有活動性結核病，晚期或播散性疾病的患者缺乏有效的T細胞免疫［7-9］。同抑制效應T細胞反應與活躍性結核或播散性疾病中MDSCs的旺盛擴增有關［10］。本研究顯示，MDSCs的擴增與IFN?γ+CD4+T細胞呈負相關。眾所周知MDSCs能夠抑制IFN?γ+CD4+T細胞的產生。

圖4 IFN?γ教育抑制CD33+HLA?DRlow MDSCs抑制T細胞活化Fig.4 IFN?γ educate inhibition CD33+HLA?DRlow MDSCs from inhibiting Tcell activation

IFN?γ最近被認為是MDSC擴增和小鼠免疫抑制功能的基本分子［11-12］。一方面，據報道，IFN?γ通過降低抗凋亡蛋白Bcl2a的表達負調節粒細胞-MDSC的存活，并連續抑制粒細胞-MDSC的抑制功能，阻斷IFN?γ直接損害單核細胞-MDS的抑制功能［13-15］。另一方面，在具有 IFN?γ-或 IFN?γR-/-腫瘤的小鼠中，MDSC的表型，積累和抑制功能與來自野生型小鼠的相似物類似，表明IFN?γ不是MDSC的關鍵調節劑。表明IFN?γ處理將人腫瘤相關巨噬細胞（TAM）從免疫抑制轉變為免疫刺激細胞并阻止TAM從其前體產生。到目前為止，關于IFN?γ對人MDSC的影響知之甚少。來自健康個體的IFN?γ-培養的CD33+HLA?DRlowMDSC比GM?csf和IL?6-誘導的CD33+HLADRlowMDSC具有更少的抑制性質，作為T細胞活化，增殖和IFN?γ產生的恢復以及Treg誘導減少的證據。故IFN?γ抑制了人類MDSCs的抑制功能。由GM?csf和IL?6誘導的MDSC產生的免疫抑制的唯一子集是CD33+HLA?DRlow細胞群，和CD33+HLA?DR-細胞完全沒有抑制活性。抑制性活動可能不是MDSCs的穩定特征，而是暫時的狀態，這將由MDSCs遷移的微環境中的本地信號改變。

圖5 IFN?γ教育抑制CD33+HLA?DRlow MDSC抑制Th1應答并且促進Treg擴展Fig.5 IFN?γ educate inhibition CD33+HLA?DRlow MDSCinhibitis of Th1 responses and promotes Treg expansion

本研究表明，CD33+HLA?DRlowMDSC的免疫抑制活性通過阻斷PD?1而顯著減少，CD33+HLA?DRlowMDSC的免疫抑制功能是PD?1/PD?Ls途徑依賴性的。然而，PDL1在細胞因子誘導的MDSC中的可比較的表達水平不能支持PD?L1在受IFN?γ培養的抑制性較弱的MDSC上的作用。PD?L1的中和不會消除未治療的慢性淋巴細胞性白血病患者外周血中PD?L1hiCD11b+CD33+CD14+HLA?DR1單核細胞MDSCs的免疫抑制功能。值得注意的是，盡管PD?L1可能是顯性負抑制分子，但PD?L2被認為是可能的第二重要抑制分子。PD?L2與PD?1的相對親和力高于PD?L1，因此如果PD?L1在相同水平上表達，PD?L1與PD?L1結合的能力會超出PD?L1。因此，與IFN?γ-受教育的CD33+HLA?DRlowMDSC相比，更高水平的PD?L2負責GM?csf和IL?6誘導的CD33+HLA?DRlowMDSC更強的抑制功能。

綜上所述，MDSCs的積累與TB的疾病進展有關。此外，M.tb感染誘導了一個適當的微環境來驅動MDSCs的積累，其抑制適應性免疫反應以促進持續感染。而且，產生IFN?γ的細胞通過抑制細胞-細胞接觸介導的免疫抑制來抑制MDSC的抑制活性，從而增強了抗分枝桿菌反應以控制疾病進展。