Peutz?Jeghers綜合征惡性腫瘤相關的STK11基因突變分析

王媛媛 鄧秀金 陳靜 馮潔 吳保平 王志青

南方醫科大學南方醫院1腫瘤科，2消化科（廣州 510515）

Peutz?Jeghers綜合征（Peutz?Jeghers syndrome，PJS，MIM#175200），亦稱黑斑息肉綜合征，是一種以胃腸道多發錯構瘤樣息肉、皮膚黏膜色素沉著為特征，并具高度腫瘤易感性的罕見常染色體顯性遺傳病［1］。患者不僅胃腸道息肉可惡變，還可伴發胃腸道外許多器官的惡性腫瘤，包括肝臟、胰腺、肺及婦科腫瘤等［2］。PJS息肉可累及消化道任何部位，手術無法進行根治［3］，患者可能同時并發多種腫瘤［4］且發生惡性腫瘤的風險是普通人群的9～18倍［5］，中國PJS患者還表現出較嚴重的癌癥擔憂［6］，嚴重影響其生存質量。因此，尋找惡性腫瘤發生相關的預警信號非常重要。抑癌基因STK11（serine threonine kinase 11，MIM#602216）基因突變被認為是PJS的致病原因［7］，由9個外顯子組成，編碼區為1 302 bp，編碼一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶STK11。目前已發現STK11基因致病突變300余種，但突變類型和惡性腫瘤的關系尚無定論。

本研究將以2個惡性腫瘤高發的PJS家系作為研究對象，報道一種可能與PJS惡性腫瘤發生相關的STK11基因突變類型，為PJS家系進行惡性腫瘤的提前預警、監測及隨訪提供新的理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料在廣東省廣州市南方醫院腫瘤科病房和消化科門診采集到2個PJS家系（圖1），分別來自廣東省（圖1A）和福建省（圖1B），共調查9例患者的臨床病理資料，其中6例患者和10例家系中健康成員提供外周血標本。研究中PJS患者均符合以下4條中的任何1條［8］：（1）2個或多個息肉，經組織學診斷符合PJS特點，即起源于黏膜肌層的平滑肌像樹枝樣延伸至息肉的黏膜下層；（2）具有PJS家族史且伴有任何數量的PJ息肉；（3）具有PJS家族史且有典型的皮膚黏膜色素沉著；（4）典型的皮膚黏膜色素沉著且伴有任何數量的PJ息肉。另外取100例無親緣關系的健康人作為正常對照。本次研究遵循知情同意的原則，并取得南方醫科大學南方醫院醫學倫理委員會審查批準。

圖1 2個發生惡性腫瘤的Peutz?Jeghers綜合征家系圖譜（*表示提供外周血標本）Fig.1 Pedigree of the PJSfamily associated with carcinomas（Participants in the DNA analysis are marked with an asterisk）

1.2 實驗方法

1.2.1 外周血DNA提取取2個家系中PJS患者和健康成員外周血樣本16份及100例家系外健康人靜脈血，采用上海生工生物工程技術服務有限公司SK1261試劑盒提取外周血DNA。

1.2.2 PCR擴增體系和反應條件對STK11基因9個外顯子及側翼序列進行PCR，引物由廣州瑞真生物公司合成，引物序列、PCR反應體系及反應參數見參考文獻［9］。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度。

1.2.3 DNA測序PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海生工生物工程技術服務有限公司進行Sanger測序，結果采用SequenceScanner 1.0軟件（Applied Biosystems）進行分析并與UCSC數據庫（http：//genome.ucsc.edu/）中的STK11基因序列進行比對。

1.2.4 MLPA分析MLPA試劑盒SALSA P101?B1 STK11購自MRC?Holland公司，按照試劑盒操作說明完成MLPA反應［10］。MLPA反應產物用ABI3500DX測序儀進行毛細管電泳，結果采用MRC?Holland公司開發的MLPA數據分析專用軟件Coffalyser進行分析。拷貝數根據電泳峰面積比值進行判定：正常2拷貝的比值比參考范圍為0.85～1.15，比值比0.35～0.65判斷為雜合缺失突變，比值比1.35～1.65判斷為雜合重復突變。

表1 PJS患者臨床特征及惡性腫瘤發生情況Tab.1 Characteristics of affected individuals in two Chinese PJSfamilies

2 結果

2.1 PJS患者臨床特征及惡性腫瘤發生情況2個家系中9例PJS患者臨床特征見表1。分析發現PJS患者惡性腫瘤發生率為44.4%（4/9），發生惡性腫瘤的平均年齡為38.8歲（29～50歲），其中，家系1患者Ⅲ：3在30和44歲時發生2種不同的惡性腫瘤，分別為卵巢癌和小腸腺癌。此外，患者Ⅳ：1于28歲時發現結腸一直徑約3 cm的巨大錯構瘤性息肉已發生腺瘤樣變，并伴有中重度不典型增生。

2.2 PJS家系STK11基因突變分析應用Sanger測序檢測STK11基因突變，在2個PJS家系的患者中均未發現任何變異。隨后應用MLPA技術檢測大片段重復或缺失，在這兩個無親緣關系的家系中，兩位先證者均發現STK11基因第一號外顯子（Exon1）缺失突變c.-1114-?_290+?del（圖2）。

進一步MLPA驗證發現，兩個PJS家系中，所有患者均檢測到該缺失突變，而家系中表型正常的成員和健康對照者未檢出該突變，因此該突變在兩個PJS家系中呈現基因型-表型共分離。同時，生物信息學分析提示該突變可能會嚴重影響STK11基因轉錄和表達，降低STK11激酶活性。由此推測，STK11基因Exon1缺失突變c.-1114-?_290+?del是導致患者出現PJS臨床表現的致病性突變，而非基因多態性，且研究家系中惡性腫瘤高發可能與Exon1缺失突變密切相關。

圖2 STK11基因MLPA檢測結果（紅色箭頭指示缺失的Exon1 3個探針位置）Fig.2 MLPA analysis of STK11 gene（Red arrows mark the deleted Exon 1，three probes）

3 討論

PJS惡性腫瘤嚴重威脅患者的生命健康，國外研究表明［11-12］PJS患者病死率高達32%，惡性腫瘤是導致死亡的主要原因；惡性腫瘤發生率為19%～32%，平均年齡42～45歲，以胃腸道腫瘤（51%～69%）為主，其次為婦科腫瘤（22%～26%），消化道惡性腫瘤的風險是普通人群的50倍。日前報道PJS患惡性腫瘤的最小年齡為13歲，為小腸腺癌［13］。本研究中2個中國PJS家系惡性腫瘤發生率高，9例PJS患者中4例患癌，1例患者腸道息肉已發生上皮內瘤變，且發生年齡較輕，可見，PJS惡性腫瘤已成為危害患者健康的主要問題，也是臨床醫生和科研工作者最為關注的問題。然而，該疾病中，研究STK11基因型和表型關系是焦點。

迄今，STK11基因的突變類型、突變位點與PJS患者發生惡性腫瘤的關系仍不清楚。國外研究者先后報道STK11基因第三號外顯子突變、第六號外顯子突變、羧基端和ⅥB～Ⅷ功能區的錯義突變與惡性腫瘤相關［14-16］，本研究組曾報道XI功能區突變可能與PJS錯構瘤發生上皮內瘤變有關［10］。而本次研究中值得注意的是，在惡性腫瘤高發的2個獨立的PJS家系中同時發現STK11基因Exon1缺失突變，提示這一突變不僅是患者出現PJS臨床表現的致病性突變，還可能與惡性腫瘤密切相關。有趣的是，意大利學者RESTA等［17］曾報道一個PJS家系攜帶STK11基因Exon1基因缺失突變，且其中1例患者43歲時患乳腺癌，另有研究提示STK11基因可能通過影響HER?2蛋白表達而導致乳腺癌的發生［18］。這些結果印證了本研究報道的STK11基因一號外顯子缺失突變對PJS的致病性以及與惡性腫瘤的相關性，但仍然需要更多國內外PJS患者進一步證實這一結論。

STK11在機體內通過多種機制發揮抑癌作用，主要由N-末端核定位信號結構域、高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域以及C-末端調節結構域組成，其激酶催化區域位于第44-309位氨基酸殘基。本研究報道的STK11基因Exon1缺失突變c.-1114-?_290+?del，可能會影響STK11基因轉錄和表達，降低STK11激酶活性；也可能通過干擾其與STRAD和MO25結合形成復合體，破壞STK11激酶活化功能；還可能通過阻礙AMPK、MAPK等信號通路或通過影響多種與腫瘤發生相關的蛋白如p53、Cdc37、Hsp90、PTEN與STK11的相互作用［15］，進而影響細胞增殖、細胞極性和能量代謝［19］，最終導致PJS患者息肉形成甚至惡性腫瘤發生。我們將在后續研究中進一步探討STK11基因Exon1缺失突變的致病及致癌機制，從而為PJS疾病的精確診療提供新的有效途徑。

總之，本研究聯合應用Sanger測序和MLPA檢測技術發現了2個中國PJS家系共有的STK11基因致病性突變，即Exon1缺失突變c.-1114-?_290+?del，且該突變很可能與PJS惡性腫瘤密切相關，為PJS家系進行遺傳咨詢、產前診斷［20］以及惡性腫瘤預警、監測和隨訪提供了新的理論依據。