白藜蘆醇對(duì)缺氧誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用及其可能機(jī)制

陳四喜 陳瑞紅 包春宇 徐剛

胃癌是世界上最常見(jiàn)的原發(fā)性胃腸道惡性腫瘤之一[1]，盡管目前在診斷方法上有所改進(jìn)，但胃癌患者的預(yù)后仍然極差，且大多數(shù)癌癥患者的死因不是原發(fā)腫瘤而是腫瘤轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生需要上皮細(xì)胞的遷移和侵襲，而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)[2]。研究表明，缺氧可能是EMT的誘發(fā)因素之一，介導(dǎo)這一反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一即缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)，且HIF-1α與細(xì)胞增生、轉(zhuǎn)移、血管生成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)[3]。已有大量研究結(jié)果表明白藜蘆醇能顯著的抑制多種腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，但在不同的腫瘤細(xì)胞中，其機(jī)制卻有所不同[4-5]。本研究目的在于探討白藜蘆醇是否對(duì)缺氧誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程具有抑制作用，為胃癌的治療提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 胃癌SGC-7901細(xì)胞由河南省信陽(yáng)市解放軍第一五四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 胎牛血清：浙江天航生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基：美國(guó)Hyclone公司；MTT粉、CoCl2粉：美國(guó)Sigma公司；TRIzol試劑：美國(guó)Invitrogen公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：美國(guó)Fermentas公司；2×Tag Mix：北京威格拉斯生物技術(shù)公司；RNA引物：上海生工生物工程有限公司；HIF-1α、Snail、E-cadherin及vimentin兔抗人單克隆抗體：美國(guó)Cell Signaling Technology公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗：北京中杉金橋有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MTT試驗(yàn) 復(fù)蘇胃癌細(xì)胞SGC-7901置于37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種于96孔板中，分別配制白藜蘆醇濃度為300、200、150、100、50、25、12.5和6.25 μmol/L的培養(yǎng)液，加入96孔板中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔中再加入濃度為5 mg/mL的MTT液20μL，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，吸去上清液，每孔中加入100 μL DMSO試劑進(jìn)行溶解，將96孔板放在酶標(biāo)儀上，對(duì)各孔在490 nm處的吸光值進(jìn)行測(cè)定。取每組6個(gè)平行孔吸光值的均數(shù)，按照公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(inhibition rate，IR)：IR＝(1－加藥組吸光值均數(shù)/對(duì)數(shù)組吸光值均數(shù))×100%。然后根據(jù)IR值計(jì)算出白藜蘆醇對(duì)胃癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50值)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中白藜蘆醇濃度均參照該濃度。

1.3.2 細(xì)胞劃痕試驗(yàn) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞，接種于六孔板中，分別設(shè)立對(duì)照組(普通培養(yǎng)基)、白藜蘆醇組(含白藜蘆醇的培養(yǎng)基)、缺氧組(含CoCl2的培養(yǎng)基)、白藜蘆醇＋缺氧組(含白藜蘆醇和CoCl2的培養(yǎng)基)，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用10 μL槍頭沿板底垂直劃痕，再用PBS液進(jìn)行沖洗3次，去除劃下的細(xì)胞，再將六孔板放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，取樣拍照。

1.3.3 熒光定量PCR試驗(yàn) 將四組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后進(jìn)行收集，按照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)上的步驟，提取出各組胃癌細(xì)胞的總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)上的步驟將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，參照引物序列，使用ABI 7300 Real-time PCR System對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，然后對(duì)擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行分析(引物序列表1)。將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA稀釋后，取2 μL作為模板，配置好反應(yīng)體系。按照初始變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 15 s，退火/延伸60 ℃ 31 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每份cDNA樣品在相同的條件下按以上步驟進(jìn)行基因表達(dá)水平的檢測(cè)，所有的樣品均重復(fù)試驗(yàn)3次，采用相對(duì)定量2－△△Ct法計(jì)算目的基因的mRNA表達(dá)水平。

表1 RT-qPCR引物序列及擴(kuò)增片段大小

1.3.4 Western Blot試驗(yàn) 將對(duì)照組、白藜蘆醇組、缺氧組、白藜蘆醇＋缺氧組四組細(xì)胞分別培養(yǎng)24 h后進(jìn)行收集。使用細(xì)胞裂解液提取出總蛋白，制備成蛋白樣品后，在電泳儀上依次進(jìn)行灌膠、上樣、電泳，在轉(zhuǎn)膜儀上進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，結(jié)束后將膜泡在封閉液(5%的牛奶)里在室溫條件下封閉1 h，再將膜泡在一抗稀釋液中，雜交袋封閉，4℃過(guò)夜，進(jìn)行一抗孵育。用TBST溶液在室溫下對(duì)孵育后的膜進(jìn)行脫色。用同上方法進(jìn)行二抗孵育，然后依次化學(xué)發(fā)光、顯影、定影。將定影后的膠片進(jìn)行拍照，通過(guò)Image J軟件測(cè)定的特異性蛋白條帶的密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以上試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用SPSS 16.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料結(jié)果均采用(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間比較采用方差分析方法比較。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT試驗(yàn)檢測(cè) MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示在相同培養(yǎng)條件下，白藜蘆醇對(duì)正常組和缺氧組胃癌細(xì)胞SGC-7901的增生均有顯著的抑制作用，且隨著白藜蘆醇濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)。在缺氧和正常條件下，白藜蘆醇對(duì)SGC-7901細(xì)胞的IC50值分別為(42.69±2.04)μmol/L和(40.57±1.83)μmol/L(圖1)，綜合考慮，我們將白藜蘆醇濃度40 μmol/L作為后續(xù)試驗(yàn)的藥物濃度。

圖1 MTT試驗(yàn)檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)缺氧誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞SGC-7901的增生抑制作用

2.2 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)結(jié)果 在顯微鏡下觀察并測(cè)量各組細(xì)胞劃痕間寬度，在胃癌細(xì)胞SGC-7901中，結(jié)果均顯示劃痕寬度白藜蘆醇組＞對(duì)照組＞白藜蘆醇＋缺氧組＞缺氧組，提示缺氧誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞后(缺氧組)細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)，而白藜蘆醇作用后(白藜蘆醇＋缺氧組)細(xì)胞的侵襲能力明顯減弱，表明白藜蘆醇對(duì)缺氧誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞SGC-7901的侵襲轉(zhuǎn)移有明顯的抑制作用(圖2)。

圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)四組胃癌SGC-7901細(xì)胞的遷移侵襲能力×100

2.3 熒光定量PCR試驗(yàn)結(jié)果 在胃癌細(xì)胞SGC-7901中，各組HIF-1α mRNA的相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯升高或降低(差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞0.05，圖3)。而與對(duì)照組相比，缺氧組中Snail、vimentin mRNA相對(duì)表達(dá)水平均明顯升高，E-cadherin mRNA表達(dá)水平均明顯降低，而白藜蘆醇＋缺氧組表達(dá)水平與對(duì)照組相似，較缺氧組表達(dá)水平明顯降低。白藜蘆醇組與對(duì)照組相比，Snail、vimentin mRNA表達(dá)水平下降，E-cadherin mRNA表達(dá)水平升高，即缺氧誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞后，對(duì)缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α基因的表達(dá)無(wú)明顯影響，而導(dǎo)致胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，白藜蘆醇對(duì)缺氧誘導(dǎo)的胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子基因表達(dá)有明顯的抑制作用(圖4)。

圖3 熒光定量PCR試驗(yàn)檢測(cè)各組胃癌細(xì)胞中HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量

圖4 熒光定量PCR試驗(yàn)檢測(cè)各組胃癌細(xì)胞中EMT相關(guān)分子mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.4 Western Blot試驗(yàn)結(jié)果 在胃癌細(xì)胞SGC-7901中，與對(duì)照組相比，缺氧組HIF-1α蛋白表達(dá)水平明顯升高，而白藜蘆醇＋缺氧組表達(dá)水平與對(duì)照組相似，較缺氧組表達(dá)水平明顯降低。白藜蘆醇組與對(duì)照組相比，HIF-1α蛋白表達(dá)水平下降(圖5)。與對(duì)照組相比，缺氧組Snail、vimentin蛋白表達(dá)水平明顯升高，E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯降低，而白藜蘆醇＋缺氧組表達(dá)水平與對(duì)照組相似，較缺氧組表達(dá)水平明顯降低。白藜蘆醇組與對(duì)照組相比，Snail、vimentin蛋白表達(dá)水平下降，E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高，即缺氧誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞后，導(dǎo)致胃癌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子蛋白表達(dá)明顯升高，而白藜蘆醇對(duì)缺氧誘導(dǎo)的胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子蛋白表達(dá)有明顯的抑制作用(圖6)。

圖5 Western Blot試驗(yàn)檢測(cè)四組胃癌SGC-7901細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白的表達(dá)情況

圖6 Western Blot試驗(yàn)檢測(cè)四組胃癌SGC-7901細(xì)胞內(nèi)Snail、E-cadherin和vimentin蛋白的表達(dá)情況

3 討論

白藜蘆醇是一種低分子的植物抗毒素，是植物在應(yīng)對(duì)某些外界刺激時(shí)所產(chǎn)生的一種代謝產(chǎn)物。研究表明，在多種惡性腫瘤如前列腺癌、乳腺癌及結(jié)腸癌中，白藜蘆醇表現(xiàn)出了較好的抗腫瘤活性[6]。

微環(huán)境缺氧是實(shí)體腫瘤的一種常見(jiàn)特性，其導(dǎo)致腫瘤微血管系統(tǒng)的異常及腫瘤的快速生長(zhǎng)。隨著實(shí)體腫瘤的不斷生長(zhǎng)，對(duì)脈管系統(tǒng)氧供需求增大，腫瘤內(nèi)出現(xiàn)缺氧狀態(tài)，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的缺氧反應(yīng)體系，HIF-1α是腫瘤細(xì)胞為了耐受缺氧而表達(dá)的一種因子，在常氧狀態(tài)時(shí)被泛素化降解。當(dāng)腫瘤細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)時(shí)，泛素化降解過(guò)程被阻斷，HIF-1α在細(xì)胞內(nèi)逐漸累積。在多種實(shí)體腫瘤中均可發(fā)現(xiàn)HIF-1α的高表達(dá)和累積[7-9]。本研究顯示，缺氧條件下，HIF-1α在胃癌細(xì)胞中存在累積。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是原發(fā)腫瘤上皮癌細(xì)胞失去細(xì)胞極性和細(xì)胞間黏附，并增加遷移和侵襲特性，從而成為間充質(zhì)細(xì)胞的一種生物學(xué)過(guò)程。腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[10]，因此通過(guò)阻止其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移已成為目前腫瘤治療的新策略之一。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)因素很多，缺氧也被認(rèn)為是其中重要的誘導(dǎo)因素之一。缺氧誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的EMT過(guò)程主要是通過(guò)HIF-1α介導(dǎo)的[11]。在缺氧狀態(tài)下，HIF-1α通過(guò)上調(diào)Snail基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)Snail的表達(dá)從而引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[12]。本研究顯示，缺氧可以誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的EMT，主要表現(xiàn)為相關(guān)因子vimentin的表達(dá)增加和E-cadherin的表達(dá)減少。

本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧通過(guò)引起胃癌細(xì)胞中HIF-1α的累積，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的EMT過(guò)程，表現(xiàn)為EMT相關(guān)因子Snail、vimentin表達(dá)的上調(diào)和E-cadherin表達(dá)的下調(diào)，同時(shí)表現(xiàn)為胃癌細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)，而白藜蘆醇能顯著抑制這一過(guò)程，且白藜蘆醇抑制HIF-1α蛋白的累積而對(duì)HIF-1α mRNA水平無(wú)影響，具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

有研究顯示，白藜蘆醇是組蛋白去乙酰化酶Sirtuin1(SIRT1)最有效的激活劑，且白藜蘆醇的多種活性都是通過(guò)SIRT1介導(dǎo)的，SIRT1可以使腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子和其他蛋白去乙酰化而失去活性[13]。已有研究證實(shí)，組蛋白乙酰化酶PCAF可以通過(guò)對(duì)HIF-1α的乙酰化作用使其激活，同時(shí)被激活的HIF-1α又可以在SIRT1的去乙酰化作用下失去活性，PCAF和SIRTl分別通過(guò)乙酰化和去乙酰化作用來(lái)調(diào)控HIF-1α的活性[14-15]，這表明，白藜蘆醇可以通過(guò)SIRT1對(duì)HIF-1α的去乙酰化作用使HIF-1α失去活性。

綜上所述，本研究表明，白藜蘆醇對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響是通過(guò)抑制HIF-1α的累積從而抑制胃癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的，盡管其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，但這一結(jié)果為胃癌的靶向化療提供了新的方向，同時(shí)白藜蘆醇是否通過(guò)SIRT1的去乙酰化作用抑制HIF-1α的累積從而抑制胃癌細(xì)胞的EMT過(guò)程還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。