HPLC-DAD法測定復合維生素B片中5種組分的含量

胡曉琴，韓 春

（長治學院 化學系，山西 長治 046011）

復合維生素B片（Vitamin B Compound Tablets）處方源于《衛生部頒藥品標準》化學藥品及制劑第一冊 WS1-73（B）-89[1]，由維生素 B1（Vitamin B1）、維生素 B2（Vitamin B2）、煙酰胺（Nicotinamide）、維生素 B6（Vitamin B6）和泛酸鈣（Calcium Pantothenate）等5種功效組分加工而成，臨床用于預防和治療B族維生素缺乏導致的營養不良、口角炎、神經系統等疾病[2]。現行質量標準《衛生部頒藥品標準》化學藥品及制劑第一冊WS1-73（B）-89分別使用重量法測定維生素B1、分光光度法測維生素B2、滴定法測煙酰胺[1]，方法操作繁瑣、誤差較大，并且未對維生素B6和泛酸鈣進行評價。現有文獻中常用高效液相色譜法或超高效液相色譜法測定維生素B1、維生素B2、煙酰胺和維生素B6含量[3-12]；但未見同時測定復合維生素B片5種有效組分的報道，且對于該藥中泛酸鈣的含量測定報道甚少。本研究采用HPLC-DAD法，選擇以乙腈緩沖液（6 mmol/L己烷磺酸鈉，1 mmol/L庚烷磺酸鈉混合溶液，用冰醋酸調節pH值至4.5）（20:80）為流動相，同時測定復合維生素B片5種有效組分，可為復合維生素B片質量控制提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

島津LC-20AT型高效液相色譜儀，配有SPD-M20A二極管陣列檢測器（DAD）和LabSolutions色譜工作站（日本島津公司）。維生素B1（批號：100390-201505，含量：100%，100 mg/支）、維生素B2（批號：100369-201504，含量：100%，100 mg/支）、煙酰胺（批號：100115-201604，含量：100%，100 mg/支）、維生素 B6（批號：100116-201404，含量：100%，100 mg/支）、泛酸鈣（批號：100370-201402，含量：100%，100 mg/支）均購自中國食品藥品檢定研究院。復合維生素B片（山西 ****有限公司，批號：140602、140603、140604、140605、140606、140607、160102、160706）；甲醇、乙腈為色譜純，冰乙酸、無水乙醇為分析純，鹽酸為優級純，水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈緩沖液（6 mmol/L 己烷磺酸鈉，1 mmol/L庚烷磺酸鈉混合溶液，用冰醋酸調節 pH 值至 4.5）（20:80）；柱溫：30℃；流速：1 ml/min；進樣量：10 μL；檢測波長：265 nm（維生素B1、維生素B2和煙酰胺）和210 nm（維生素B6和泛酸鈣）。

1.3 溶液配制

對照品儲備液：分別精密稱取維生素B1對照品24.32 mg、維生素B2對照品12.53 mg、煙酰胺對照品80.46mg和泛酸鈣對照品10.25 mg，置10 ml量瓶中，加適量1%冰醋酸，振搖溶解后定容，作為對照品儲備液（1）；另精密稱取維生素B6對照品15.87 mg，置100 ml量瓶中，加適量1%冰醋酸，振搖溶解后定容，作為對照品儲備液（2），避光低溫保存。

對照品溶液：分別精密量取上述對照品儲備溶液（1）1.0 ml、對照品儲備溶液（2）2.0 ml，置 25 ml量瓶中，加1%冰醋酸溶液稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液。

供試品溶液：取本品20片，精密稱定，研細，精密稱取適量（約相當于3mg維生素B1），置50 ml量瓶中，加入1%冰醋酸 40 ml超聲（300 W，45 kHz）處理15 min，放冷，用1%冰醋酸定容，用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，避光保存。

2 結果與分析

2.1 系統適用性試驗

精密吸取“1.3”項下的混合對照品溶液和供試品溶液，按“1.2”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖（如圖1）。由圖1可知，供試品與對照品中維生素B1、維生素B2、煙酰胺、維生素B6和泛酸鈣色譜峰的保留時間相對應。維生素B1、維生素B2、煙酰胺、維生素B6和泛酸鈣的保留時間分別為11.3 min、9.2 min、6.3 min、7.6 min 和 3.6 min。

圖1 供試品溶液和對照品溶液色譜圖

2.2 線性試驗

分別精密吸取“1.3”項下對照品貯備液（1）0.05 ml、0.1 ml、0.2 ml、0.5 ml、1.0 ml分別置 5 ml量瓶中，依次加入“1.3”項下對照品貯備液（2）0.1 ml、0.2 ml、0.4 ml、1.0 ml、2.0 ml，加 1%冰醋酸定容，搖勻，得系列混合對照品溶液。按“1.2”項下色譜條件進樣分析，以各組分的濃度x為橫坐標，相應峰面積y為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程及r，同時計算5種有效組分的檢測限和定量限，結果見表1。

表1 回歸方程、檢測限和定量限

2.3 精密度、穩定性和重復性試驗

精密吸取“1.3”項下的混合對照品溶液，按“1.2”項下色譜條件連續進樣6次，計算得維生素B1、維生素B2、煙酰胺、維生素B6和泛酸鈣峰面積的RSD分別為0.56%、0.73%、0.48%、0.96%和0.87%，表明方法精密度良好。

精密吸取同一供試品溶液，分別于 0、2、4、8、10 h，按“1.2”項下色譜條件進樣，測定峰面積，結果維生素B1、維生素B2、煙酰胺、維生素B6和泛酸鈣峰面積的RSD分別為0.74%、1.08%、0.95%、1.25%和0.96%，表明供試品溶液在10 h內穩定。

取同一批次復合維生素B片（批號：140605），按“1.3”項下方法制備供試品溶液，共6份，分別進樣測定，結果維生素B1、維生素B2、煙酰胺、維生素B6和泛酸鈣含量的RSD分別為0.57%、0.70%、0.82%、1.16%和0.61%，色譜峰相對保留時間的RSD分別為1.08%、0.93%、0.96%、0.85%和0.47%，表明方法重復性良好。

2.4 加樣回收率試驗

取已知各組分含量（維生素B1、維生素B2、煙酰胺、維生素B6和泛酸鈣含量分別為 3.11、1.54、10.17、0.21 和 1.04 mg/片，平均片重：0.0743 g）的復合維生素B片20片，研細，精密稱取0.07 g，共18份，分別置50 ml量瓶中，依次加入“1.3”項下對照品儲備液（1）、（2）0.6、1.2、2.0 ml各 6 份，按“1.3”項下方法制備供試品溶液，分別進樣分析，計算回收率。結果見表2，RSD<2.7%，加樣回收率均滿足要求。

表2 加樣回收率測定結果（%）

2.5 樣品含量的測定

按“1.3”項下方法制備8個批次樣品的供試品溶液，按“1.2”項下色譜條件進行測定，分別計算5種組分的含量，同時與《衛生部頒藥品標準》化學藥品及制劑第一冊WS1-73(B)-89收載方法比較，檢測結果基本相符，相對偏差在1.0%范圍內，說明該方法能夠滿足復合維生素B中有效組分含量測定的要求，結果見表3。

表3 含量測定結果（n=3）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

采用島津SPD-M20A二極管陣列檢測器（PDA），按本文色譜條件對混合標準溶液進行200～600 nm全波長掃描，提取5種物質的紫外吸收圖譜。可知維生素B1在248、254 nm處有較強的吸收峰；維生素B2在254、267、270 nm處有較強的吸收峰；煙酰胺在254 nm處有最大吸收峰，維生素B6在210、280 nm處有較強的吸收峰，泛酸鈣在210 nm處有最大吸收峰；為兼顧多種組分同時檢測，并綜合考慮靈敏度、分離度等因素，分別考察各波長處的色譜圖，發現維生素B1、維生素B2和煙酰胺在265 nm處，維生素B6和泛酸鈣在210 nm峰形好，分離度滿足要求，各組分在相應保留時間處有較強吸收，色譜圖見圖1。所以，本試驗采用了不同波長檢測，維生素B1、維生素B2和煙酰胺的檢測波長為265 nm及維生素B6和泛酸鈣的檢測波長為210 nm。

3.2 流動相的選擇

試驗過程中分別考察了乙腈水、甲醇水、甲醇1%冰醋酸及緩沖鹽、乙腈0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液、乙腈緩沖液（己烷磺酸鈉和庚烷磺酸鈉混合溶液）等流動相體系，結果顯示，以乙腈緩沖液（己烷磺酸鈉和庚烷磺酸鈉混合溶液）為流動相時的總體分離效果較好，但個別組分色譜分離度欠佳；在此基礎上調整了流動相的比例、己烷磺酸鈉和庚烷磺酸鈉的濃度，以及緩沖液的pH值，最終選定以乙腈緩沖液（6 mmol/L己烷磺酸鈉，1 mmol/L庚烷磺酸鈉混合溶液，用冰醋酸調節pH值至4.5）（20:80）為流動相，等度洗脫，各色譜峰的對稱性良好、分離度滿足要求。

3.3 提取溶劑的考察

根據5種組分的性質，考慮到維生素B2、泛酸鈣在酸性強度大時不穩定，而維生素B1酸度弱時提取不完全，對比了不同酸度的冰醋酸溶液對5種組分的提取效率，最終，選用1%冰醋酸溶液作為溶劑。