乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑體外釋放度測定方法研究

張振東 劉希望 馬寧 申棟帥 李劍勇

摘要：研究乙酰氨基阿維菌素（Eprinomectin，EPR）原位凝膠注射劑體外釋放度的測定方法，采用高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）測定EPR原位凝膠注射劑的體外釋放度。結果表明，采用HPLC測定EPR原位凝膠注射劑體外釋放度方法是可行的，體外釋放曲線表明EPR原位凝膠注射劑有緩釋的特點。以pH 7.4的PBS緩沖溶液作為釋放介質的HPLC適用于EPR原位凝膠注射劑體外釋放度的測定。

關鍵詞：乙酰氨基阿維菌素；HPLC；原位凝膠注射劑；體外釋放度

中圖分類號：S859.79 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）10-0095-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.10.024

Study on in Vitro Release of Eprinomectin in Situ Gel Injection

ZHANG Zhen-dong，LIU Xi-wang，MA Ning，SHEN Dong-shuai，LI Jian-yong

（Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Science of CAAS/Key Lab of Veterinary Pharmaceutical Development，Ministry of Agriculture/Key Lab of New Animal Drug Project of Gansu Province，Lanzhou 730050，China）

Abstract： The purpose of this study was to determine the release of in situ gel injection of Eprinomectin in vitro （EPR）. The vitro release of EPR in situ gel injection was measured by high performance liquid chromatography（HPLC） using PBS buffer as a release medium. The results showed that it is feasible to determine the vitro release of EPR in situ gel injection by HPLC and the vitro release curve showed that EPR in situ gel injection had the characteristics of sustained release. This conclusion was that the HPLC method was suitable for the vitro release of EPR in situ gel injection with pH 7.4 PBS buffer solution as a release medium.

Key words： eprinomectin； HPLC； in situ gel injections； vitro release

乙酰氨基阿維菌素是由默克公司1997年開發出的大環內酯類體內外殺蟲劑，是一種高效、廣譜、低殘留的獸用新一代抗寄生蟲藥物[1]。乙酰氨基阿維菌素具有廣譜、高效、用量小和安全程度高等優點，對線蟲、昆蟲和螨蟲均具有高效殺滅作用[2-4]。目前，國內商品化的制劑只有1% EPR注射液，為國家二類新獸藥[5]。臨床主要應用于奶牛、肉牛等動物，在羊、豬、兔等動物上進行的療效試驗也取得了較好的治療效果，在其他動物上也有比較廣泛的應用潛力[6]。但EPR注射液皮下注射給藥，生物利用度低、藥效維持時間短，從而給臨床治療效果帶來嚴重影響。因此，提高生物利用度和延長有效血藥濃度維持時間的EPR新制劑開發成為國內外防治寄生蟲病的研究熱點[7]。蘭州畜牧與獸藥研究所獸藥研究室開發了一種EPR原位凝膠注射劑，擬用于奶牛、肉牛寄生蟲病的治療。本試驗以PBS緩沖溶液作為釋放介質，采用HPLC法對EPR原位凝膠注射劑的體外釋放度[8]進行了方法學研究。

1 材料與方法

1.1 儀器和試藥

Agilent-LC 1290II型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；CPA224S型電子天平（德國賽多利斯公司）；IS-RDV1型恒溫振蕩器（上海賽伯樂儀器有限公司）。

乙酰氨基阿維菌素標準品，B1a含量為95.4%，B1b含量為2.37%，批號K0471411，購自中國獸醫藥品監察所；EPR原位凝膠注射劑，批號170816；乙睛、甲醇，色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司產品；磷酸鹽緩沖溶液（1×PBS），北京索萊寶科技有限公司；疊氮化鈉（DDN），山東西亞化學股份有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS），國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫：35 ℃；流動相：乙腈∶甲酸水（0.1%的甲酸）=60∶40；流速：0.4 mL/min；紫外檢測波長：245 nm；進樣量：2 μL。

1.3 溶液的制備

1.3.1 標準品工作液的制備 精密稱取乙酰氨基阿維菌素標準品102 mg，加無水乙醇定容至100 mL，制得濃度為1.02 mg/mL的標準品儲備液。使用前用流動相稀釋成系列濃度的標準品工作液。

1.3.2 供試品溶液的制備 EPR原位凝膠注射劑搖勻，用移液管精確量取1 mL，置50 mL容量瓶中，用無水乙醇25 mL，分5次洗滌移液管內壁，洗液并入容量瓶中，搖勻，置水浴中超聲10 min，加無水乙醇緩慢稀釋至刻度，搖勻。精確量取1 mL，置10 mL容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

1.3.3 陰性對照液的制備 按處方比例精確稱取EPR原位凝膠注射劑中除EPR原料藥外的其他成分，同EPR原位凝膠注射劑工藝制備，再按供試品溶液的制備方法處理，即獲得陰性對照液。

1.3.4 標準曲線的制備 精確量取標準品儲備液適量加到流動相中，得濃度分別為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μg/mL的標準品工作液，取2 μL進樣測定，以峰面積（A）對EPR濃度（C）進行線性回歸，計算線性回歸方程。

1.4 精密度試驗

取EPR標準品工作液，連續重復進樣6次，進樣量2 μL，依法測定峰面積，觀察其峰面積測量值的相對標準偏差。

1.5 穩定性試驗

分別在供試品溶液制備0、4、8、12、24 h后，精確量取2 μL，依法測定峰面積，考察其穩定性[9]。

1.6 加樣回收率試驗

精確稱取EPR對照品和輔料適量，按處方制成EPR原位凝膠注射劑的樣品，然后制備高、中、低3種濃度共9份供試品溶液，測定EPR濃度，與加入值進行比較，計算加樣回收率。

1.7 EPR原位凝膠注射劑樣品釋放度的測定方法

將200 mg的EPR原位凝膠注射劑加入5 mL上述PBS緩沖液中，在恒溫振蕩器中振蕩，振蕩條件為50 r/min，37 ℃。分別于1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30 d將緩沖介質取出，加入5 mL新的緩沖介質，繼續振搖。取釋放介質2 μL進HPLC進行測定，并根據峰面積計算釋放介質中的EPR濃度。釋放度（%）=（釋放介質中的EPR濃度×5 mL）/原位凝膠注射劑中EPR總量×100%。

2 結果與分析

2.1 色譜行為

陰性對照液、標準品溶液和供試品溶液的色譜見圖1，EPR分離度良好，峰形尖銳，保留時間5.1～5.2 min，陰性對照液和供試品溶液中的其他組分對EPR的測定無干擾，方法專屬性良好。

2.2 標準曲線

以峰面積（A）對EPR濃度（C）進行線性回歸，得回歸方程為A=9 356.9C-3 041.6（r=1）線性范圍1.562 5～200 μg/mL。

2.3 精密度結果

精密度試驗結果見表1。RSD為1.48%（n=6），表明該儀器精密度符合要求。

2.4 穩定性結果

穩定性試驗結果見表2。測定液室溫放置24 h，與0 h比較含量無顯著變化，RSD為0.26%，表明樣品溶液在該試驗條件下，可以穩定24 h。

2.5 加樣回收率結果

加樣回收率試驗結果見表3，平均回收率為99.61%，RSD為0.47%（n=9）。

2.6 EPR原位凝膠注射劑樣品釋放曲線

對EPR原位凝膠注射劑按照上述方法進行體外釋放度測定，以時間和累計釋放量為坐標軸繪制釋放曲線圖2。結果表明，EPR原位凝膠注射劑有緩釋的特點。

3 小結與討論

EPR標準品溶液經紫外可見分光光度計掃描，在240～250 nm的波長處有吸收峰[10]。最初選擇242 nm作為檢測波長，在色譜條件優化時發現，當選擇245 nm作為檢測波長時，檢測的靈敏度顯著提高，故最終將檢測波長定為245 nm。為避免EPR和注射劑中輔料的色譜行為相互干擾，篩選了甲醇-水、乙腈-水、丙二醇-水等流動相[11，12]，并根據色譜分離效果調整流動相組分的體積比，最終確定流動相為乙腈∶甲酸水（0.1%甲酸）=55∶45。在該色譜條件下，EPR與雜質分離效果良好，回收率、精密度、穩定性等試驗結果進一步驗證了試驗所建立的方法專屬性良好。在EPR原位凝膠注射劑體外釋放度的測定過程中，使用恒溫振蕩器進行恒溫振蕩，其振蕩條件為50 r/min以及使用PBS緩沖溶液作為釋放介質都是為了更加真實地模擬動物體內環境[13]。EPR原位凝膠注射劑體外釋放度測定方法學考察結果驗證了該方法的可行性。EPR原位凝膠注射劑體外釋放度測定結果表明，該劑型具有緩釋、長效的特點。

參考文獻：

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