南海具抑菌活性微生物的篩選與鑒定

田良玉 彭淑婭 顧卉卉 蔣超 朱道辰 周曉見

摘要：在南海深海海泥中采用平板法分離具有抑菌活性的微生物，以紙片法研究其抗菌活性，對分離到的活性細菌進行16S rRNA測序并構建系統進化樹，對細菌進行生長特性研究。結果表明，從海泥中分離到9株具有抑菌活性的微生物，分別屬于Bacillus和Salinicola屬。菌株j65可在含鹽率20%的條件下生長，除菌株gu8外其他菌株均可在pH 6～10的環境下生長。

關鍵詞：海洋微生物；分離鑒定；抑菌試驗；系統進化樹

中圖分類號：Q939.99 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）10-0065-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.10.015

Isolation and Identification of Antibacterial Bacteria in South China Sea

TIAN Liang-yu1，PENG Shu-ya1，GU Hui-hui2，JIANG Chao2，ZHU Dao-chen2，ZHOU Xiao-jian1

（1.College of Environmental Science & Engineering，Yangzhou University，Yangzhou 225127，Jiangsu，China；

2.College of Environment and Safety Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 222013，Jiangsu，China）

Abstract： The bacteria which had antibacterial activity was isolated from the sediments of South China Sea by plate isolation.The antibacterial activity of isolates were identified by paper disk method. The active isolates were identified by 16S rRNA sequencing and the phylogenetic tree constructed by neighbour-joining method. The growth characteristics of bacteria were studied. The results showed that nine active antibacterial bacteria belonging to genus Bacillus and Salinicola were isolated from sediment samples. It was indicated that strain j65 could grow at the concentration of 20% NaCl，and all strains could grow at the range of pH 6～10，except for strain gu8.

Key words： marine microorganism； isolation and identification； antibacterial experiment； phylogenetic tree

海洋獨特的高壓、高鹽、高溫、嚴寒、無光照等環境特點，造就了海洋微生物物種的獨特性與多樣性[1]。微生物在這樣的特殊環境中，演化出了特殊的代謝途徑，能夠產生許多結構新穎和功能奇特的代謝產物[2，3]。近年來，人們從陸地微生物菌種資源中尋找新的活性物質和新藥已變得越來越困難[3]，抗藥性問題也日益嚴重[4]。因此，對海洋微生物的研究越來越受到世界各國和組織的重視[4，5]，對從海洋微生物中獲取新的特效活性物質和新藥寄予了極大的希望[2，5，6]。目前，有研究者從海洋動物和海洋植物體表或者體內分離篩選得到具有抑菌活性的海洋微生物[1，7]，而直接從海洋深處的海泥中分離、篩選與鑒定具有抑菌活性微生物的研究則鮮有報道[6，7]。

隨著人們對畜產品安全和環保意識的不斷加強，益生菌作為抗生素的替代品受到廣泛的關注，并逐漸應用于養殖動物的營養和飼料添加中。有研究指出，益生菌作為抗生素的最佳替代品之一，具有增強宿主抵抗力、提高集體健康水平、減少疾病發生等優點[8]。作為新型的飼料添加劑，益生菌已被廣泛應用于水產、畜禽養殖產業中。本研究擬從南海海泥中篩選抑菌海洋微生物，對其進行鑒定和構建系統進化樹，并研究其生理特性，是新藥開發的一項重要的前期工作[9]；同時，也可為畜禽飼料益生菌提供新的來源，為南海海洋微生物資源進一步開發提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 采用南海海洋深處的海泥。

1.1.2 分離純化培養基 M1培養基：淀粉10 g，酵母粉4 g，蛋白胨2 g，純化瓊脂8 g，海水定容至1 000 mL，pH 7.2～7.6，121 ℃滅菌25 min[10]。

2216E培養基：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，維生素1 mL（過濾滅菌），磷酸高鐵0.1 g，純化瓊脂18 g，海水定容至1 000 mL。pH 7.2～7.6，121 ℃滅菌20 min。

高氏1號培養基：硝酸鉀1 g，磷酸氫二鉀0.5 g， 七水合硫酸鎂0.5 g，七水合硫酸鐵 0.5 g，pH 7.2～7.6，121 ℃滅菌20 min。

ISP3培養基：燕麥粉20 g，微量元素溶液W 1 mL，純化瓊脂8 g，海水定容至1 000 mL，pH 7.2～7.6，121 ℃滅菌20 min。

ISP4培養基：淀粉10 g，磷酸氫二鉀1 g，七水合硫酸鎂1 g，硫化氨2 g，碳酸鈣2 g，七水合硫酸鐵0.001 g，氯化錳0.001 g，純化瓊脂8 g，海水定容至1 000 mL，pH 7.2～7.6，121 ℃滅菌20 min[11]。

ISP5培養基：L-天門冬酰胺1 g（過濾滅菌），甘油10 g，磷酸氫二鉀1 g，微量元素溶液W 1 mL，純化瓊脂8 g，海水定容至1 000 mL，pH 7.2～7.6，121 ℃滅菌20 min。

改良羅氏培養基：谷氨酸鈉7.2 g，檸檬酸鈉0.6 g，磷酸氫二鉀2.4 g，硫酸鎂0.1 g，孔雀綠0.4 g，丙三醇12 mL，雞卵液1 000 mL，海水定容至600 mL，90 ℃滅菌1.5 min。

無機鹽瓊脂培養基：淀粉20 g，磷酸氫二鉀0.5 g，七水合硫酸鎂0.5 g，硝酸鉀1 g，七水合硫酸亞鐵0.01 g，純化瓊脂8 g，海水定容至1 000 mL，pH 7.2～7.6，121 ℃滅菌20 min。

瓊脂培養基：純化瓊脂8 g，海水1 000 mL，pH 7.2～7.6，121 ℃滅菌20 min。

以上培養基用500 mL燒杯分裝，每瓶裝200 mL，過濾或高溫滅菌。培養基中海水均為人工海水，微量元素溶液W為Wolfe Trace[12]。人工海水組成：NaCl 20 g/L，MgSO4·7H2O 6 g/L，MgCl2·6H2O 3 g/L，（NH4）2SO4 1 g/L，NaHCO3 0.2 g/L，NaBr 0.05 g/L，CaCl2·2H2O 0.3 g/L，KH2PO4 0.42 g/L，SrCl·6H2O 0.02 g/L，Fe（NH4）citrate 0.01g/L，KCl 0.5 g/L。維生素組分配方：煙酸10 mg/L，生物素4 mg/L，泛酸10 mg/L，硫辛酸10 mg/L，葉酸10 mg/L，維生素B1 10 mg/L，維生素B2 10 mg/L，維生素B6 10 mg/L，維生素B12 10 mg/L，對氨基苯甲酸10 mg/L。Wolfe Trace組分配方：Nitrilotracetic acid 1.5 g/L， MgSO4·7H2O 3.0 g/L，MnSO4·2H2O 0.5 g/L，NaCl 1.0 g/L，FeSO4·7H2O 0.1 g/L，CoCl2 0.1 g/L，CaCl2·2H2O 0.1 g/L， ZnSO4 0.1 g/L， CuSO4·5H2O 0.01 g/L， AlK（SO4）2 0.01 g/L，H3BO3 0.1 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.01 g/L。

1.1.3 主要試劑與儀器 Taq酶、dNTP等均購自寶生物工程（大連）有限公司，16S rDNA引物購自上海捷瑞生物工程有限公司，其他試劑均為分析純，購自國藥集團。凝膠成像儀、電泳儀、PCR擴增儀購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 分離純化、培養、保藏 海泥處理：用無菌藥勺秤取1 g于10 mL無菌生理鹽水中，用渦旋器激烈振蕩制成均勻的渾濁液，最后稀釋成10-2 g/mL。將處理后的海泥樣品用涂布法在瓊脂培養基上進行涂布[13]。分別吸取50 μL稀釋液在上述每種培養基上進行涂布，每種樣品2～3個重復，在37 ℃培養箱中培養。1 d后觀察平板中菌落生長狀況，避免菌苔生成影響分離取樣。2～4 d后觀察平板，根據菌落的不同顏色、不同形態進行劃線分離，采用區域劃線法，繼續37 ℃培養，挑取單個菌落，繼續重復劃線，純化2～3次，得到純菌株。挑取單個菌落于試管培養液中進行培養，于37 ℃搖床中培養1～2 d，在無菌臺上吸取200 μL菌液以及200 μL 30%的甘油1∶1進行保存。存放于-80 ℃冰箱。

1.2.2 抑菌試驗 采用紙片法進行抑菌試驗[14-16]。選用國標濾紙，剪成6 mm直徑的濾紙片，121 ℃滅菌20 min后烘干。分別在不同瓊脂培養基上加入稀釋適當濃度的指示菌懸液200 μL，涂抹均勻。在紙片上加入50 μL待測菌株的去細胞培養液，以無菌培養基作空白對照，待自然干燥后輕放在涂有指示菌的培養皿中，37 ℃培養1 d。

指示菌液的配制：分別取經過37 ℃培養24 h的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌培養物與生理鹽水1∶9稀釋，且用渦旋器振蕩使菌體均勻分散。

操作步驟：稀釋指示菌液，涂布平板；加入載有相應測試菌液的濾紙片；37 ℃培養1 d，觀察指示菌生長情況。

1.2.3 分子生物學鑒定 制備模板：將分離純化的菌株進行活化培養1 d，提取細菌基因組DNA[17]。

PCR擴增反應體系：TaKaRa Tag（5 μg/μL）0.25 μL，10×PCR Buffer（Mg2+ Free）5 μL， MgCl2（25 mmol/L）3 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）4 μL，模板DNA 2 μL，引物1（20 μmol/L）1 μL，引物2（20 μmol/L）1 μL，滅菌去離子水定容至50 μL[17]。

PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃ 5 min；16 ℃保存。以1%瓊脂糖凝膠檢測16S rRNA的PCR擴增結果[18]。

1.2.4 構建系統進化樹 將PCR擴增的16S rDNA產物進行凝膠純化后，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序。用多重序列比對軟件ClustalW2進行新型分離菌株16S rRNA序列與具有抑菌活性細菌的16S rRNA序列比對，用分子進化遺傳分析軟件MEGA 5.0進行序列同源性分析，采用鄰接法（Neighbour-Joining）構建系統發育樹[19]。

1.2.5 鹽及pH耐受性試驗 測試含鹽率設置為5%、8%、10%、13%、15%、20%，測試pH設置為6、9、10、11，根據活性微生物的生長情況確定鹽及pH耐受性。

2 結果與分析

2.1 抑菌微生物的分離篩選

對海泥樣品進行平板涂布分離，通過觀察菌落形態特征，挑選單菌落。經純化，并結合后期的抑菌活性試驗，共得到9株活性菌株。將獲得的16S rRNA基因序列，提交到NCBI數據庫進行BLAST同源性比對[19，20]。發現所獲得9株活性菌株分別屬于9種不同基因表型，除j65外，其余8株均屬于Bacillus（表1）。

2.2 抑菌作用

以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌，9株菌株的抑菌活性見表2。由表2可知，菌株E205b、gu8、gu6、j65對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定抑制作用。菌株gu16、gu22、j24、j57對大腸桿菌有明顯抑制作用，而菌株gu2對金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用。其中gu6、j65對兩種指示菌均有明顯抑制作用，活性最優。

2.3 系統發育樹的建立

將菌株gu6序列在NCBI中進行BLAST比對，比對結果顯示其16S rRNA基因序列與Bacillus vietnamensis、B. aquimaris的同源性最高，同源性分別為96.90%、95.67%。在比對結果中選取同源性較高菌株的16S rRNA基因序列，使用MEGA7.0軟件進行序列比對，并用鄰接法構建系統發育樹[21，22]，從系統發育樹（圖1）可以看出，菌株gu6與B. aquimaris同在一個進化分支上，可以認定gu6屬于芽孢桿菌屬。

將菌株j65序列在NCBI中進行BLAST比對，比對結果顯示其16S rRNA基因序列與Salinicola salarius同源性最高，同源性達98.73%。在比對結果中選取同源性較高菌株的16S rRNA基因序列，使用MEGA7.0軟件進行序列比對，并用鄰接法構建系統發育樹[21，22]，從系統發育樹（圖2）可以看出，菌株j65與S. acroporae同在一個進化分支上，可以認定j65屬于棲鹽田菌屬。

鑒于篩選的兩株細菌同源性、生理生化特征和已知菌種存在一定差異，表明菌株gu6和j65可能是潛在的新種，還需根據這兩株菌株的細胞化學組成和基因組DNA-DNA雜交結果來確定[13]。

2.4 抑菌微生物的鹽、pH耐受性

由表3可知，當含鹽率在15%及以下時，除j24在含鹽率15%時不能生長外，其余菌株均可以生長。當含鹽率達到20%時，只有菌株j65可以生長。

由表4可知，當pH在6～10時，除菌株gu8在pH為10時不可以生長外，所有菌株均可以生長。當pH大于11時，所有菌株均不能生長。

3 小結與討論

通過不同培養基對海泥樣品中的微生物進行分離、純化和抑菌試驗，篩選出9株具有抑菌活性的微生物。其中8株菌株對大腸桿菌有一定的抑菌作用，5株菌株對葡萄球菌表現出一定的抑菌活性，有4株菌株對二者均有一定的抑制作用，其中菌株gu6和j65活性最優。16S rRNA序列分析表明，本研究分離到的兩株高活性菌株gu6和j65分別屬于芽孢桿菌和棲鹽田菌屬，且由于生理生化特征的特殊性，可能為潛在的新種[5]。表明中國南海地區微生物具有獨特性和多樣性，在后續研究中，可以對這一特殊環境的微生物進行全面系統的研究。

通過對9株菌株鹽和pH的耐受性研究，發現菌株對酸堿變化、高鹽度均具有一定耐受性，對常見的致病菌具有較好的抑菌作用，易于培養。但菌株的其他生理生化特征和抑菌機理均有待進一步研究。以期在益生菌制劑、畜禽養殖等病害防治領域開發具有應用前景的抗菌產品。

參考文獻：

[1] 薛超波，王國良，金 珊，等.海洋微生物多樣性研究進展[J].海洋科學進展，2004，22（3）：377-384.

[2] 胡申才.具細胞毒活性海洋微生物的分離篩選及次級代謝物的研究[D].武漢：華中農業大學，2005.

[3] 梁靜娟，詹 萍，龐宗文.具有抗真菌活性的海洋微生物的分離篩選[J].現代食品科技，2006，22（2）：92-94.

[4] 王 幸，吳文惠，陳志華，等.海洋微生物次生代謝產物的結構特征和生物活性的研究進展[J].中國天然藥物，2010，8（4）：309-320.

[5] 何建瑜，趙榮濤，陳永妍，等.海洋微生物多樣性研究技術進展[J].生命科學，2012，24（6）：526-530.

[6] 姜 鍵，楊寶靈，元 起，等.具有抑菌活性的海洋細菌的分離與鑒定[J].生物技術，2004，14（6）：28-30.

[7] 繆 莉，鄭忠輝，蘇文金.共附生海洋微生物活性物質的研究進展[J].海洋通報，2002，21（3）：62-68.

[8] RUBIO R，JOFR？魪 A，MART？魱N B，et al. Characterization of lactic acid bacteria isolated from infantfaeces as potential probiotic starter cultures for fermented sausages[J].Food Microbiology，2014，38（4）：303-311.

[9] ELISASHVILI V，KACHLISHVILI E. Physiological regulation of laccase and manganese peroxidase production by white-rot Basidiomycetes[J].Journal of Biotechnology，2009，144（1）：37-42.

[10] 郭娜燕，連蓮香，黃耀堅，等.福建沿海沉積物放線菌的多樣性及生物活性[J].中國抗生素雜志，2017，42（1）：20-27.

[11] 周德慶.微生物學教程[M].第三版.北京：高等教育出版社，2011.

[12] 康 白.微生態學[M].第三版.遼寧大連：大連出版社，1988.

[13] 沈 萍.微生物學[M].北京：高等教育出版社，2000.

[14] HAHN M G. Microbial elicitors and their receptors in plants[J].Annual Review of Phytopathology，1996，34：387-412.

[15] 向亞萍，陳志誼，羅楚平，等.芽孢桿菌的抑菌活性與其產脂肽類抗生素的相關性[J].中國農業科學，2015，48（20）：4064-4076.

[16] 黃秀梨.微生物學[M].北京：高等教育出版社，1998.

[17] 高增貴，陳 捷，高洪敏，等.玉米莖腐病菌產生的細胞壁降解酶種類及其活性分析[J].植物病理學報，2000，30（2）：148-152.

[18] 朱飛舟，陳利玉，陳漢春.16S rRNA基因序列分析法鑒定病原細菌[J].中南大學學報（醫學版），2013，38（10）：1035-1041.

[19] 李 聰，蔡 巖，周永燦，等.海南羅非魚致病性維氏氣單胞菌分離鑒定及藥敏特性研究[J].水產科學，2015，34（10）：640-646.

[20] ZHU D，TANABE S H，XIE C X，et al. Bacterial community composition of South China Sea sediments through pyrosequencing-based analysis of 16S rRNA genes[J].PloS One，2013， 8（10）：e78501.

[21] 林鳳敏，姬文秀，尹禎焅，等.長白山天池水可培養細菌的16S rRNA鑒定[J].延邊大學農學學報，2010，32（2）：77-81.

[22] ZHU D C，TANABE S H，XIE C X，et al. Bacillus ligniniphilus sp. nov. an alkaliphilic and halotolerant bacterium isolated from sediments of the South China Sea[J].International Journal of Systematic & Evolutionary Microbiology，2014，64：1712-1717.