遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)對(duì)老齡大鼠骨折愈合的影響及研究

周萌，黃江，安帥，曹光磊*，沈惠良

(1.北京積水潭醫(yī)院骨科，北京 100035；2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院骨科，北京 100053)

隨著年齡的增長，骨丟失與骨形成的平衡逐漸被打破，破骨細(xì)胞的作用增加，骨吸收作用增強(qiáng)以維持機(jī)體內(nèi)血鈣水平的穩(wěn)定，同時(shí)伴隨著骨小梁稀疏以及骨皮質(zhì)逐漸變薄，最終造成骨的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[1]。

骨骼的血供約占心輸出量的10%，具有高度的血管化[2]。骨折時(shí)，骨組織和細(xì)胞處于低氧環(huán)境中，而骨折愈合就是在這種缺血缺氧的環(huán)境中發(fā)生發(fā)展。在骨發(fā)育和再生過程中，血管的新生起到了至關(guān)重要的作用[3-4]。我們之前的研究中提到，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)與其受體結(jié)合后可以發(fā)揮一系列促血管生成反應(yīng)[5]。但血管新生是多個(gè)生長因子共同參與的復(fù)雜過程，不僅僅是由單個(gè)生長因子決定的，而低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)作為上游調(diào)控基因比單個(gè)基因效率更高[6]。

HIF-1α是調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)的核心轉(zhuǎn)錄因子，在骨折愈合過程中，HIF-1α通路的激活是骨骼再生所需的新血管生成的關(guān)鍵介質(zhì)，是血管與骨形成替代的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，有研究表明應(yīng)用HIF激活劑可以起到改善骨愈合的治療作用[7]。應(yīng)用HIF-1α基因敲除的成骨細(xì)胞的小鼠骨折模型進(jìn)行研究證實(shí)，當(dāng)HIF-1α通路被激活時(shí)，成骨細(xì)胞的低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)、堿性磷酸酶(alkaline phosphates，ALP )、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、I型膠原以及Runx2等表型增加，促進(jìn)成骨功能；同時(shí)在HIF-1α的刺激下新生血管增加進(jìn)而促進(jìn)骨量、骨體積增加以及骨的形成[8-9]。

Zhao等[10]在2003年研究發(fā)現(xiàn)在再灌注的早期，經(jīng)歷短暫的缺血再灌注處理的缺血心肌可以減少梗死體積，并且據(jù)此提出了缺血后適應(yīng)的概念。Zhao等[11]在遠(yuǎn)隔器官上應(yīng)用IpsotC，并將其命名為遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)(remote ischemic post-conditioning，RIPC)，整個(gè)過程中涉及到了腺苷、細(xì)胞自噬、HIF-1α、VEGF等的變化[12-13]。有研究表明，HIF-1α、VEGF作為重要因子參與了肢體缺血后適應(yīng)的過程。

我們通過之前的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)通過肢體缺血后適應(yīng)造成的缺血缺氧環(huán)境可以促進(jìn)成年大鼠的骨折愈合[14]，本研究我們采用老年大鼠來模擬老年患者的機(jī)體情況，進(jìn)一步研究低氧環(huán)境是否能夠促進(jìn)老年大鼠的骨折愈合。

1 資料與方法

1.1 老齡大鼠脛骨閉合骨折模型的建立 本次研究所涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，SD老齡大鼠均來自首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。老齡大鼠的體重為(820±20)g，月齡18～20個(gè)月，均為雄性，每籠飼養(yǎng)一只，自由進(jìn)食水，動(dòng)物房飼養(yǎng)環(huán)境復(fù)合SPF級(jí)別，飼養(yǎng)室為恒溫恒濕環(huán)境，溫度控制在23～25℃，濕度控制在40%～60%。

將老齡鼠用2%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔麻醉成功后，將左下肢外展外旋位放置于自制大鼠閉合骨折模型造模器的兩塊L型鐵砧凹槽中，將骨刀放置于下肢脛骨中上1/3部分，固定下肢。助手將600 g砝碼提高22 cm后松開砝碼，將力傳導(dǎo)至大鼠左下肢，進(jìn)而造成脛骨中上1/3骨折。取左下肢髕前切口，縱行劈開髕腱，于脛骨平臺(tái)中后部電鉆開髓，并延髓腔方向插入1 mm克氏針，復(fù)位骨折后，將克氏針順行插入遠(yuǎn)端，檢查骨折端無明顯臺(tái)階感后，折彎克氏針尾部，逐層閉合切口，以安爾碘涂抹切口。我們將64只老齡大鼠隨機(jī)分為兩組：肢體缺血后適應(yīng)組(RIPC組)32只，對(duì)照組(Control組)32只。

1.2 肢體缺血后適應(yīng)模型 我們應(yīng)用首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院低氧研究所自行研發(fā)的大鼠肢體缺血適應(yīng)儀對(duì)肢體缺血適應(yīng)組進(jìn)行缺血后適應(yīng)干預(yù)。將儀器的18 mm袖帶綁在大鼠右下肢(手術(shù)對(duì)側(cè))的大腿中部部分，加壓至240 mm Hg，阻斷局部血流，加壓10 min后由程序自動(dòng)減壓至0 mm Hg，間隔10 min繼續(xù)加壓，往復(fù)3個(gè)循環(huán)。造模后當(dāng)天即開始進(jìn)行肢體缺血適應(yīng)，每天兩次，每次間隔時(shí)間不小于4 h，連續(xù)干預(yù)14 d。為了檢測大鼠肢體缺血適應(yīng)儀的有效性，我們應(yīng)用激光多普勒血流儀(Periflux System 5000，Perimed AB，J?rf?lla，Sweden)對(duì)袖帶遠(yuǎn)端動(dòng)脈血流進(jìn)行監(jiān)測：袖帶加壓后，遠(yuǎn)端血流可完全被阻斷；減壓后血流立即恢復(fù)(見圖1)。

圖1 大鼠肢體缺血適應(yīng)儀加壓前后局部血流圖

1.3 Micro-CT掃描分析 在骨折術(shù)后第14天、28天以及42天每組隨機(jī)選取3只老齡大鼠，脫頸處死后，完整取下手術(shù)側(cè)脛骨，取出克氏針后放入多聚甲醛中固定48 h。應(yīng)用首都醫(yī)科大學(xué)的Inveon Micro-CT(Siemens AG，Munich，Germany)對(duì)脛骨標(biāo)本進(jìn)行逐一掃描(層厚15 μm，500 μa，80 kv)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Mimics 16.0(Materialise NV，Leuven，Belgium)進(jìn)行三維重建，測得骨痂體積[15]。在矢狀位、冠狀位和軸位骨折線兩端各選取三個(gè)層面，每個(gè)層面在骨痂部分選取三個(gè)點(diǎn)測量灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 生物力學(xué)檢測 將骨折術(shù)后28 d和42 d取下的完整脛骨標(biāo)本應(yīng)用SWD-10萬能試驗(yàn)機(jī)(長春試驗(yàn)機(jī)研究所)進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)檢測其力學(xué)性能[16]。將標(biāo)本兩端進(jìn)行包埋置于試驗(yàn)機(jī)兩點(diǎn)支架上，兩點(diǎn)支架間的距離為8 mm，在速度為10 mm/min的負(fù)載下加載負(fù)荷。所檢測的指標(biāo)包括最大負(fù)荷和強(qiáng)度。

1.5 Western Blot 取出液氮中凍存的骨折后各組的骨痂組織標(biāo)本，每組5例，按Western-blot的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟進(jìn)行，蛋白質(zhì)抽提和濃度測定，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，加一抗鼠抗HIF-1α單克隆抗體(1︰1 000)和骨鈣素單克隆抗體(1︰800)過夜，加熒光二抗后緩沖鹽溶液洗膜，化學(xué)發(fā)光試劑顯色，用紅外線掃描成像系統(tǒng)(Odyssey，LI-COR)進(jìn)行掃膜，觀察HIF-1α、VEGF、OCN、ALP和Runx2蛋白水平的變化。

1.6 RT-PCR檢測 RT-PCR檢測骨痂中HIF-1a、VEGF、Runx2、OCN和ALP mRNA的表達(dá)：取出液氮中凍存的骨折后7、14、28 d組的骨痂組織(包括骨折線上下各0.5 cm脛骨組織)標(biāo)本，每組4例，研碎成粉末狀，按TRIzol試劑盒(Invitrogen)說明抽提骨痂組織的總RNA；取總RNA 2 μg，按PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Envision)說明進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄；以RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)(Envision)，總反應(yīng)體系為20 μL。PCR引物序列及反應(yīng)條件見表1。應(yīng)用ABI7900 System software SDS V2.3分析軟件系統(tǒng)在PCR反應(yīng)終止后，檢測擴(kuò)增曲線和光譜的是否有異常變化，進(jìn)而評(píng)估本次實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。對(duì)于每個(gè)樣品中的每個(gè)目的mRNA均進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，進(jìn)而取平均值。

表1 各目標(biāo)基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1 兩種低氧方式干預(yù)后骨組織重建和再生的影像學(xué)觀察對(duì)比 為評(píng)估和對(duì)比兩種低氧干預(yù)方式骨痂的質(zhì)量以及骨折的愈合情況，我們對(duì)骨折后14 d、28 d、42 d的兩組老齡大鼠左下肢脛骨標(biāo)本進(jìn)行Micro-CT掃描。我們通過骨折后14 d脛骨橫軸方向的截圖可以看出低氧干預(yù)后骨痂體積明顯大于對(duì)照組，同時(shí)從骨折后42 d的三維重建圖來看低氧干預(yù)后老齡大鼠的脛骨塑形更好(見圖2)。經(jīng)過Micro-CT的配套軟件以及Mimics的統(tǒng)計(jì)測量，在術(shù)后第14、28天和42天RIPC組的骨痂體積明顯高于對(duì)照組(P<0.01)(見圖3)；在術(shù)后第14、28和42天，RIPC組骨折線附近的灰度值明顯高于對(duì)照組(見圖4)，間接表明RIPC組骨折線附近的骨密度在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組，換言之RIPC組骨痂部分的礦化速度以及骨折愈合程度均優(yōu)于對(duì)照組。

2.2 生物力學(xué)檢測 為了進(jìn)一步分析骨折愈合過程中的骨強(qiáng)度進(jìn)而評(píng)估骨折愈合質(zhì)量，我們通過三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)對(duì)骨折后28 d和42 d的兩組老齡大鼠脛骨進(jìn)行了檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相對(duì)于對(duì)照組，RIPC組大鼠脛骨標(biāo)本所能承受的最大負(fù)荷和強(qiáng)度均有明顯優(yōu)勢(P<0.05)(見圖5)，也就是說在同一時(shí)間點(diǎn)RIPC組的骨折愈合質(zhì)量要優(yōu)于對(duì)照組。這也印證了Micro-CT給出的結(jié)論，RIPC組相對(duì)于對(duì)照組來說對(duì)于骨折修復(fù)早期能夠更快的促進(jìn)骨痂骨化，增強(qiáng)骨折局部的強(qiáng)度。

圖2 Micro-CT顯示兩組老齡鼠骨折后14 d和42 d骨痂情況

圖3 骨折后各時(shí)間點(diǎn)兩組的骨痂體積對(duì)比 圖4 骨折后各時(shí)間點(diǎn)兩組骨痂灰度值對(duì)比

圖5 骨折后28 d和42 d兩組老齡鼠脛骨最大負(fù)荷和強(qiáng)度對(duì)比

圖6 RT-PCR比較各時(shí)間點(diǎn)兩組老齡鼠骨痂組織中HIF-1α、VEGF、Runx2、ALP及OCN的mRNA水平

圖7 Western Blot比較各個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組老齡鼠骨痂組織中HIF-1α、VEGF、Runx2、ALP及OCN的蛋白表達(dá)水平

2.3 低氧干預(yù)激活HIF-1α通路進(jìn)而激活VEFG以及下游靶基因來促進(jìn)骨折愈合 我們應(yīng)用PCR技術(shù)以及Western Blot技術(shù)檢測了骨痂組織中HIF-1α、VEGF以及相關(guān)下游靶基因的mRNA水平和蛋白含量。綜合Western Blot和PCR來看，如圖6～7所示，在術(shù)后第7、14和28天時(shí)，RIPC組HIF-1α的蛋白表達(dá)含量明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。

同樣我們從VEGF的表達(dá)也可以得出相似的結(jié)論：在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，RIPC組的VEGF表達(dá)明顯高于對(duì)照組，RIPC組的相關(guān)靶基因ALP、OCN和Runx2的蛋白表達(dá)含量在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)尤其是第14天和第28天明顯高于對(duì)照組。

3 討 論

正常骨折愈合是一種復(fù)雜的過程，影響骨折愈合有許多方面的因素，包括生物、營養(yǎng)、物理和遺傳因素。之前的研究表明缺氧可能促進(jìn)骨折愈合和成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2以及成骨細(xì)胞特異性基因ALP和OCN的增加[17]。正是這些發(fā)現(xiàn)為促進(jìn)誘導(dǎo)骨組織再生提供了潛在的方式。

3.1 遠(yuǎn)隔缺血適應(yīng)對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用 遠(yuǎn)程缺血調(diào)節(jié)已被證實(shí)可以誘導(dǎo)不同冠狀動(dòng)脈區(qū)域的心肌保護(hù)[18]。Oxman等[19]報(bào)道了非侵入性的后肢缺血模型，并證明在持續(xù)缺血性損傷后可以減少大鼠心臟再灌注后的心律失常。由于這種模型操作簡便，副損傷小，許多研究已經(jīng)開始使用這種方法進(jìn)行相關(guān)的遠(yuǎn)隔缺血適應(yīng)(remote ischemic conditioning，RIC)實(shí)驗(yàn)[20-24]，并且已經(jīng)證實(shí)該方法可以減少動(dòng)物和人類其它器官的損傷，并且具有可重復(fù)性[25]。近年來的國內(nèi)外研究表明，HIF-1α及其靶基因VEGF在細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)對(duì)缺血再灌注損傷可以起到抵抗作用[26]。在本研究中，在骨組織中檢測到了HIF-1α的上調(diào)表達(dá)。HIF-1α與缺氧反應(yīng)元件靶基因啟動(dòng)子上的5'-AGCGTG-3'的核心DNA序列相互作用，上調(diào)包括VEGF在內(nèi)的多種缺氧敏感性基因[27-28]。

3.2 RIPC對(duì)骨折愈合相關(guān)因子的影響 本研究揭示了RIPC對(duì)Runx2的表達(dá)有積極影響，Runx2由于可以對(duì)成骨細(xì)胞的發(fā)育起到調(diào)節(jié)作用，同時(shí)對(duì)間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞系分化起到重要的調(diào)節(jié)作用，故被認(rèn)為是成骨細(xì)胞分化的主要控制轉(zhuǎn)錄因子[29]，在成骨細(xì)胞早期分化過程以及間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中均起到了重要的作用。

在骨折修復(fù)的過程中，成骨細(xì)胞在低氧的誘導(dǎo)下表達(dá)HIF-1α，進(jìn)而通過其信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌VEGF[30-33]。在基因水平上，HIF-1α可以直接調(diào)控VEGF及其受體的表達(dá)；此外在mRNA水平上，HIF-1α還可以通過增強(qiáng)VEGF的穩(wěn)定性來提高其表達(dá)。本研究表明HIF-1α能夠促進(jìn)Runx2的表達(dá)，分析其原因可能有以下兩個(gè)方面：a)VEGF通路介導(dǎo)。在軟骨內(nèi)成骨的過程中，周圍血管依靠軟骨膜周圍以及肥大軟骨細(xì)胞的VEGF受體增加的共同作用侵入到軟骨當(dāng)中，起到促進(jìn)軟骨內(nèi)骨化的作用。而VEGF也可以通過刺激成骨細(xì)胞的分化與遷移進(jìn)而抑制成骨細(xì)胞的凋亡來上調(diào)Runx2的表達(dá)[34]，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似；b)HIF-1α直接介導(dǎo)。有研究表明，在骨折后局部細(xì)胞聚集、成骨再生反應(yīng)發(fā)生的階段可以觀察到HIF-1α升高，這表明對(duì)于促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨分化功能，HIF-1α可以直接通過上調(diào)Runx2的表達(dá)而達(dá)到[35]。本研究顯示，Runx2的表達(dá)水平隨著HIF-1α的升高而升高，也印證了上述結(jié)論。因此我們可以推論出：為了達(dá)到促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的目的，HIF-1α不僅能夠直接促進(jìn)Runx2的分泌，還能夠通過上調(diào)VEGF的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)Runx2的分泌。

Runx2和ALP是體內(nèi)成骨所必需的，因而ALP是本研究的另一個(gè)重要因素[33，36]。ALP作為早期的分化標(biāo)志，主要在成骨細(xì)胞中表達(dá)。而OCN是成熟成骨細(xì)胞的重要標(biāo)志物，在成骨細(xì)胞祖細(xì)胞的分化中起到重要作用，在基質(zhì)合成和礦化中可以觀察到明顯上調(diào)[37-38]。所以O(shè)CN和ALP的表達(dá)程度可以反應(yīng)骨的修復(fù)形成過程。本研究證實(shí)，隨著VEGF和HIF-1α表達(dá)水平的升高，ALP與OCN的表達(dá)分泌也隨之增加，證明了OCN和ALP在成骨細(xì)胞中的表達(dá)可以通過上調(diào)HIF-1α而上調(diào)。一項(xiàng)針對(duì)兔成纖維細(xì)胞的研究表明，轉(zhuǎn)染Runx2后成纖維細(xì)胞也可以表達(dá)ALP與OC，這說明Runx2有間接調(diào)控OC和ALP的作用，也就是說HIF-1α是通過上調(diào)Runx2進(jìn)而促進(jìn)ALP與OC的表達(dá)和分泌。

3.3 RIPC對(duì)骨痂強(qiáng)度的影響 在本研究中Micro-CT證實(shí)，在骨痂形成階段(術(shù)后第14天)，RIPC組的骨痂體積明顯大于對(duì)照組，并且代表骨密度的灰度值也明顯高于對(duì)照組。在骨折后第42天，RIPC組的灰度值為(4 120±112)HU，更接近于正常皮質(zhì)骨。愈合骨組織的生物力學(xué)性質(zhì)可歸功于骨組織的密度和骨小梁的數(shù)量，生物力學(xué)分析顯示所能承受的最大負(fù)荷和強(qiáng)度均有明顯優(yōu)勢。綜上所述，以上結(jié)果表明RIPC可以增強(qiáng)成骨細(xì)胞的增殖率和骨礦化的速度。

近年來，RIPC已經(jīng)成為減少心肌缺血再灌注損傷的有效方式。使用短暫肢體缺血作為遠(yuǎn)程調(diào)節(jié)刺激的方式促進(jìn)了RIPC從實(shí)驗(yàn)室到臨床的發(fā)展，并且在逐步開始各種臨床環(huán)境中應(yīng)用[20]。本研究證實(shí)RIPC作為一種有效的方式可以用來幫助骨折愈合，并且有望作為一種切實(shí)可行的方式應(yīng)用于臨床。然而，目前有關(guān)RIPC促進(jìn)骨折愈合的分子機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。