原代小鼠卵巢上皮細胞TP53基因敲除及其生物學特征變化*

張 濤 范君文 李 丹 李文龍 孫兆增 賀喜兵 曾 林 邱業峰

(軍事醫學研究院實驗動物中心，北京 100071)

CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 及其相關的Cas基因系統是最新涌現的一種基因組編輯工具，因其操作簡便、效率高而成為熱門的基因編輯技術。該系統是細菌和古生菌抵抗外源基因侵入的獲得性免疫系統，侵入宿主的噬菌體或質粒 DNA片段整合到 CRISPR 位點，然后在 CRISPR RNAs (cr RNAs) 引導下由Cas 核酸內切酶切割外源侵入DNA序列[1]，造成DNA 雙鏈斷裂，DNA雙鏈斷裂后激活細胞的同源末端重組或非同源末端連接機制對斷裂的 DNA 進行修復，達到對基因組定點修飾的作用[2]。Cas 基因編碼的蛋白具有核酸酶和解旋酶結構域[3]。在Cas 基因附近有一段幫助 cr RNAs 成熟的轉錄活化 RNA (Trans-activating cr RNA，tracr RNA)，tracr RNA 促進 pre-cr RNA 的成熟，形成具有切割活性的 cr RNA-tracr RNA-Cas9三元復合體[4]。與鋅指核酶(ZFN)以及轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALEN)技術相比，CRISPR/Cas9 系統具有操作更簡便、靶點選擇更靈活、活性更高等優勢。

TP53為含鋅轉錄因子，直接作用或間接調節其下游基因的表達，在DNA修復、細胞周期捕獲、細胞凋亡、分化等過程中起重要作用[5- 6]。腫瘤抑制基因TP53在人類癌癥發生中突變頻率最高[7]，該基因為顯性失活，一個等位基因滅活就可以導致TP53基因功能失活[8]。TP53基因突變與功能喪失是卵巢癌中最常見的基因異常之一，卵巢癌患者中約26%～62%存在該基因突變，約50%的晚期卵巢癌患者p53蛋白功能失活，主要為漿液性、低分化卵巢癌[9- 10]。

本研究利用CRISPR/Cas9慢病毒載體系統構建TP53基因敲除小鼠原代卵巢上皮細胞系，并對細胞的生物學特性進行分析。為構建該基因敲除動物模型、研究卵巢癌的發生機制提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑：DMEM、FBS、雙抗以及胰酶購自Gibco公司，P53、β-actin一抗 購于Santa cruz公司，PCR試劑盒、BsmBI內切酶、脂質體轉染試劑盒Lipfectamine 2000購自Invitrogen公司，T4DNA 連接酶、T4 PNK購自NEB公司，SAP(蝦堿性磷酸酶)購自MBI Fermentas公司，質粒提取試劑盒購于Qiagen公司。

1.1.2質粒與菌株：LentiCRISPRv2載體購自Addgene公司；DH5α感受態菌，購自天根公司。

1.1.3細胞：小鼠卵巢上皮細胞，C57BL/6 Mouse Primary Ovarian Epithelial Cells購自Cell Biologics，Catalog No. C57-6036；293FT細胞由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1gRNA設計：在GenBank找到TP53基因(NC_000077)外顯子序列，利用CRISPR設計平臺http://crispr.mit.edu/設計gRNA引物，并進行脫靶分析。

1.2.2LentiCRISPRv2-sgRNA構建：LentiCRISPRv2質粒經BsmBⅠ酶切線性化并且去磷酸化處理，引物退火及磷酸化處理后與線性化載體16 ℃連接過夜，轉化DH5α感受態菌，挑取陽性克隆進行PCR驗證。

1.2.3慢病毒包裝：LentiCRISPRv2-sgRNA質粒和包裝質粒pCMV-VSVG、psPAX2共轉染293FT細胞，4 h后更換培養基，60 h后收集上清，分裝后-80 ℃保存。

1.2.4蛋白免疫印跡：細胞經RIPA buffer 裂解，離心取上清。80μg 蛋白上樣于10% SDS-PAGE凝膠，然后轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，p53蛋白一抗4 ℃孵育過夜，PBST洗3次，5 min/次，室溫孵育二抗1 h，洗膜后顯影。

1.2.5免疫熒光染色：細胞經4%多聚甲醛固定，PBST清洗后室溫封閉(5%山羊血清，1%BSA，0.1%Triton-X 100溶解于PBS)1 h，一抗(1∶200稀釋)4 ℃孵育過夜，PBST清洗后室溫避光孵育二抗(1∶200稀釋)1 h，加入DAPI，熒光顯微鏡下采集圖片。

1.2.6細胞增殖：MTT試劑盒測定，96孔板每孔接種8×103個細胞，每組4個重復，分別培養24 h、48 h、72 h、96 h，每孔加入10 μL MTT試劑培養4 h后加入100 μL 裂解液，室溫避光孵育2 h，讀取570 nm 吸光度A值。

1.2.7細胞遷移測定：transwell 小室進行測定，每個上室中接種5×104個細胞，懸浮于500 μL 無血清DMEM中，每組3個重復，下室加入500 μL 10%FBS DMEM培養液，培養24 h 擦去未遷移的細胞，HE染色，電子顯微鏡下拍照。

1.2.8細胞侵襲測定：transwell 小室中預先鋪一層matrigel基質膠，上室中接種8×104個細胞，懸浮于500 μL 無血清DMEM中，每組3個重復，下室加入500 μL 10%FBS DMEM培養液，培養30 h 擦去基質膠及未穿過的細胞，結晶紫染色，電子顯微鏡下拍照。

1.2.9細胞克隆形成分析：6孔板接種400個細胞/每孔，每組3個重復，培養14 d后結晶紫染色，電子顯微鏡下拍照并計數克隆數量。軟瓊脂克隆采用0.8%的瓊脂懸浮3x104個細胞/每孔，接種于6孔板中，每組3個重復，下層凝膠濃度為1.4%，每2 d補液200 μL，培養箱中培養14 d，每孔加入20 μL MTT 試劑(10 mg/mL)培養12 h，電子顯微鏡下拍照并計數。

1.3 統 計方法

2 結果

2.1 LentiCRISPRv2-sgRNA TP53構建及PCR驗證

設計的sgRNA序列為：F 5′-CACCGGTGTAATA GCTCCTGCATGG-3′，R 5′-AAACCCATGCAGGAGC TATTACACC-3′，退火及磷酸化后與線性化載體LentiCRISPRv2連接，挑取陽性克隆進行PCR鑒定，所用引物上游為LentiCRISPRv2上LKO.1_5的序列，下游為sgRNA序列，即：LKO.1_5 F5′-GACTATCATATGCTTACCGT-3′,TP53 R5′-AAACC CATGCAGGAGCTATTACACC-3′，擴增片段大小200 bp。

2.2 TP53基因穩定敲除細胞株的建立

用病毒液感染小鼠原代卵巢上皮細胞，得到TP53基因敲除細胞，并通過1 μg/mL嘌呤霉素篩選獲得該基因穩定敲除的細胞系。對照組細胞為轉導空載體的細胞。蛋白免疫印跡表明，TP53基因敲除細胞株中p53蛋白表達與對照組相比顯著降低(圖1 A)，免疫熒光顯示TP53基因敲除細胞系幾乎不表達p53蛋白(圖1B)，獲得了TP53基因完全敲除的小鼠原代卵巢上皮細胞系。

圖1 TP53基因敲除細胞p53表達顯著降低注:A. p53蛋白表達；Con，對照組；KO，TP53基因敲除組；B. p53蛋白免疫熒光染色×200Fig.1 the expression of p53 in TP53 gene knockout cells decreased significantlyNote:A. p53 protein expression；Con，control group；KO，TP53 gene knockout group；B. Immunofluorescence staining of p53 protein×200

2.3 TP53基因敲除促進細胞增殖

小鼠原代卵巢上皮細胞TP53基因敲除后增殖旺盛。與對照組相比，TP53基因敲除細胞系的增殖速度顯著升高(圖2A)，第4天時該組細胞密度明顯多于對照組(圖2B)。

圖2 TP53基因敲除促進細胞增殖注:A. 細胞增殖曲線；Con，對照組；KO，TP53基因敲除組；與同時間對照組比較，﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01，﹡﹡﹡P<0.001； B. 第4天時細胞結晶紫染色，標尺=1000 μm。Fig.2 TP53 gene knockout promoted cell proliferationNote:A. cell proliferation curve；Con，control group；KO，TP53 gene knockout group；compared with control group，﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01，﹡﹡﹡P<0.001； B. crystal violet staining at the fourth day，bar=1000 μm

2.4 TP53基因敲除導致細胞周期紊亂

TP53基因敲除組處于G1期的細胞比例顯著低于對照組(P=0.0015)，而處于S期細胞比例明顯高于對照組(P=0.02)；G2期細胞比例兩組間沒有明顯差異(P=0.8)，圖3所示。表明TP53基因敲除加速細胞DNA合成，并促進細胞周期從G1期向S期分化。

圖3 TP53基因敲除導致細胞周期紊亂注：Con，對照組；KO，TP53基因敲除組；﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01Fig.3 TP53 gene knockout led to cell cycle disordersNote;Con,control group；KO，TP53 gene knockout group；﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01

2.5 TP53基因敲除促進細胞克隆形成

小鼠原代卵巢上皮細胞TP53基因敲除后細胞克隆形成能力顯著高于對照組(P=0.01)，圖4A。細胞連續培養14 d后，TP53基因敲除組細胞集落數量和直徑均明顯大于對照組(圖4B)。軟瓊脂細胞集落形成顯示，TP53基因敲除組細胞集落數量顯著多于對照組(P=0.0002)，圖4C；但細胞集落形成率太低，直徑較小(圖4D)，表明TP53基因敲除不能夠導致明顯的細胞腫瘤轉化。

圖4 TP53基因敲除促進細胞克隆形成注：A，單層培養細胞克隆形成，Con，對照組；KO，TP53基因敲除組,﹡﹡P<0.01；B，3個重復孔中代表性1孔，6孔板；C，軟瓊脂細胞集落形成，﹡﹡﹡P<0.001；D，細胞集落光鏡照片，標尺=1000 μmFig.4 TP53 knockout promoted cell clone formationNote:A. Clone formation of monolayer culture cells；Con，control group, KO，TP53 gene knockout group,﹡﹡P<0.01；B，Representative of triplication well, 6 well plate; C，soft agar colony formation，﹡﹡﹡P<0.001；D，Cell colony picture，bar=1000 μm

圖5 TP53基因敲除促進細胞遷移侵襲注：A，遷移細胞統計，Con，對照組；KO，TP53基因敲除組；﹡﹡﹡P<0.001；B，3個重復遷移孔中代表性視野,×100；C，侵襲細胞統計，﹡﹡﹡P<0.001；D，3個重復侵襲孔中代表性視野×100Fig.5 TP53 gen knockout promoted cell migration and invasionNote：A，Cell migration analysis，Con，control group；KO，TP53 gene knockout group；﹡﹡﹡P<0.001；B，Representative field of triplicationmigration well,×100；C，Cell invasion analysis，﹡﹡﹡P<0.001；D，Representative field of triplication invasion well×100

2.6 TP53基因敲除導致細胞遷移侵襲增強

TP53基因敲除組細胞遷移能力顯著強于對照組(P=0.0032，圖5A)，穿過細胞數量明顯多于對照組(圖5 B)。侵襲試驗結果顯示，對照組沒有細胞穿過膠基質以及transwell上室小孔(圖5D)，而TP53基因敲除組細胞的侵襲能力顯著增強(圖5C)。

3 討論

TP53為含鋅轉錄因子，通過直接作用或間接調節其下游基因的表達，在DNA修復、細胞周期捕獲、細胞凋亡、分化等過程中起重要作用。該基因突變與功能喪失是卵巢癌中最常見的基因異常之一[10]?；蚓庉嬍茄芯考毎蚬δ芗捌浞肿訖C制的必要手段，本研究利用CRISPR/Cas9系統快速、經濟、有效地構建了TP53基因敲除小鼠原代卵巢上皮細胞系。LentiCRISPRv2為Zhang lab第二代CRISPR/Cas9慢病毒載體，Cas9的特異性靶點依賴于原型間隔序列3′端PAM序列，不同的Cas9突變體在基因組中擁有不同的PAM序列，來源于釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的Cas9識別5′- NGG-3′的PAM[11]，在人類基因組中約每8 bp就會出現一個，幾乎所有基因都能進行定點修飾。

TP53基因敲除引起小鼠原代卵巢上皮細胞功能改變，包括細胞增殖、細胞周期、克隆形成以及遷移侵襲能力。TP53基因敲除細胞中p53蛋白表達水平顯著降低，導致其調節功能喪失，細胞增殖旺盛。細胞周期分析表明TP53基因敲除引起細胞DNA合成加速，促進細胞周期從G1期向S期分化。p53蛋白通過反式激活基因如p21(CDK-抑制劑1)調節細胞周期，p21為細胞周期蛋白依賴性激酶。金鎮等[12]研究說明在卵巢癌SKOV3細胞中過表達TP53基因后，腫瘤細胞G1/G0期比例增加，而S期和G2/M期的比例下降，表明TP53基因過表達使卵巢癌細胞發生G1期阻滯，該基因在調節細胞周期中起重要作用。TP53基因敲除使原代細胞克隆形成能力顯著增強，但軟瓊脂中細胞集落形成率較低，而且直徑較小，表明細胞尚不具備形成腫瘤的特點。Orsulic等[13]使用禽逆轉錄病毒受體(TVA)系統將多個癌基因轉入小鼠卵巢上皮細胞建立了基因修飾小鼠模型。研究發現，TP53基因缺陷小鼠卵巢細胞可以通過至少2個癌基因(c-Myc、K-ras、Akt)組合發生轉化，而僅TP53基因缺陷不能使細胞發生腫瘤轉化。TP53基因敲除導致小鼠原代卵巢上皮細胞遷移侵襲能力增強。研究發現p53能夠促進MDM2介導的Slug的降解而增強E-cadherin的表達[14]。E-cadherin是上皮細胞的標志性蛋白，其功能喪失引起細胞間粘附作用破壞，是上皮-間質轉型的重要因素[15]。在很多p53缺失的腫瘤中發現Slug表達升高，并且伴隨E-cadherin表達喪失[16]。

上述結果表明，利用CRISPR/Cas9成功構建了TP53基因敲除小鼠原代卵巢上皮細胞系。該方法對研究基因功能有重要意義。TP53基因作為重要的抑癌基因，其功能喪失導致小鼠原代上皮細胞增殖速度加快，細胞周期紊亂，克隆形成以及遷移侵襲能力增強。該細胞模型是研究卵巢腫瘤發生機制以及基因之間關系的重要工具。