肝癌臨床標本原位移植模型的建立及其影像學評估*

譚鄧旭 張彩勤 趙寧寧 張 賀 趙 勇 白 冰 師長宏

(第四軍醫大學實驗動物中心，西安 710032)

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，死亡率高居全球前三位[1-2]。隨著HBV患者逐年增多，肝癌的發病率也在不斷增加[3-4]。肝癌早期診斷仍較困難[5]，確診時多為晚期，術后5年生存率也只有10%～20%[6-7]。因此建立模擬臨床特征的肝癌動物模型對研究肝癌的發生機制、早期診斷、術中導航和新型治療方法的評估具有重要的意義。

基于臨床新鮮肝癌腫瘤標本建立的(patient-derived xenograft, PDX)模型，可以準確地反映患者腫瘤特性[8-9]。進一步將腫瘤組織移植到與原發部位相應動物器官的原位移植(patient-derived orthotopic xenograft，PDOX)可提供適合腫瘤生長的體內微環境；有利于腫瘤特異性抗原的表達，維持腫瘤的異質性；由于移植部位血供豐富，有利于腫瘤轉移的發生。與皮下移植相比，PDOX模型更準確、客觀地模擬人體腫瘤的體內演進過程，易形成與臨床腫瘤相似的轉移特征。因此我們擬在建立肝癌PDX模型的基礎上，進一步采用原位移植的方法建立PDOX模型，通過小動物活體成像和PET/CT評估模型的特征。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性NPG小鼠，5只，8周齡，體質量25～27 g，由北京維通達生物技術有限公司提供[SCXK(京)2014～0001]；SPF級雄性裸鼠，20只，8周齡，體質量23～25 g，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供[SCXK(蘇)2016-0010]，飼養于第四軍醫大學實驗動物中心SPF級動物設施[SYXK(陜)2014-001]。設施內溫度22～24 ℃，相對濕度35%～45%，12 h晝夜交替，飲用水為高壓滅菌水，動物自由攝食飲水。

本研究中的動物實驗通過了第四軍醫大學實驗動物福利及倫理委員會批準(編號：14013)。肝癌腫瘤標本(編號：C34566)來自第四軍醫大學第一附屬醫院西京醫院，腫瘤標本的獲取經過了患者本人及家屬同意，并簽署知情同意書，僅供實驗研究。人體標本實驗通過了西京醫院醫學倫理委員會的批準(批準編號：2015432)。

1.2 設備及試劑

Caliper Lumina II小動物活體成像儀(Caliper公司，美國)，異氟烷麻醉劑(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，小動物PET-CT(Mediso公司，匈牙利)，光學顯微鏡(Olympus)，近紅外熒光染料IR-783由美國Cedars Sinai Medical Center Leland Chung 教授饋贈[10-11]，18F-FDG由西京醫院核醫學科提供，基質膠購自美國BD公司，CEA和AFP抗體由英國abcam公司提供，羊抗鼠免疫組化試劑盒(康為世紀，中國)，胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，中國)，蘇木精和伊紅染色液(北京雷根生物技術有限公司，中國)，組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，中國)。

1.3 肝癌 PDX模型的建立

新鮮肝癌手術標本置于10%胎牛血清、1%青鏈霉素1640培養基中，用冰盒快速運輸至動物房。手術器械提前高壓滅菌處理。超凈臺內標本拿出置于一次性無菌培養皿，用剪刀將標本處理至直徑1 mm左右小塊與等量基質膠1∶1混勻置于冰上。異氟烷麻醉5只NPG小鼠，手持電動剃毛機將小鼠背部接種部位毛發剃除，用酒精棉消毒并去除殘留毛發，將與基質膠混勻的腫瘤標本置于套管針內，于小鼠背部皮下注入，傷口用5-0縫合針線縫合，用碘伏消毒創口后放回籠盒觀察，命名為P0代。

1.4 PDX模型組織病理學、腫瘤標志物IHC及STR溯源評估

待腫瘤生長至1 000 mm3(腫瘤長度(l)和寬度(w)，腫瘤體積(V)，計算公式為：V=1/2 ×(w2×l))左右，異氟烷麻醉生長有腫瘤組織的1只NPG小鼠，腫瘤部位剃毛，酒精消毒后做表皮切口，取腫瘤組織置于一次性無菌培養皿，傷口重新縫合并消毒后放回飼養籠盒。將取出的腫瘤組織分為三份：一份用4%多聚甲醛固定，做病理及相關腫瘤標志物IHC檢測使用；一份使用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，酶標儀測定DNA濃度為100 ng/mL，然后用蒸餾水稀釋至5 ng/mL，送至第四軍醫大學司法鑒定中心進行STR(short tandem repeat)溯源檢測；第三份腫瘤組織保證無菌，將其切成1 mm3腫瘤塊以備PDX傳代和PDOX模型制備使用。異氟烷麻醉生長有腫瘤組織的其余4只NPG小鼠，取出腫瘤組織用于組織凍存以及在10只裸鼠皮下的傳代。

組織病理學觀察：將4%多聚甲醛固定超過24 h的腫瘤標本，進行石蠟包埋切片，HE染色封片晾干，光學顯微鏡下觀察。

肝臟腫瘤標志分子(AFP、CEA)的IHC檢測：組織切片二甲苯完全脫蠟；抗原修復；Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10～15 min降低內源性過氧化物酶；滴加 Ultra V Block封閉非特異性的背景染色；一抗AFP、CEA 分別37 ℃孵育2 h，加入二抗(羊抗鼠)室溫孵育20 min，DAB顯色后，蘇木精復染脫水透明封片晾干，光學顯微鏡下觀察。

1.5 肝癌PDOX模型的建立

離體腫瘤組織在一次性無菌平皿修剪盡可能小，36 ℃膠原蛋白酶和分散酶消化腫瘤組織20 min，期間每5 min震蕩混勻一次，加入血清終止消化，1 000 r/min離心去上清后加入基質膠和少量1640培養基懸浮腫瘤組織置于冰面。異氟烷麻醉10只裸鼠，仰臥固定，上腹部消毒；于小鼠劍突下緣處做1 cm橫向切口，充分暴露肝臟；用鈍頭鑷子將一頁肝小心牽拉出體外，將懸浮腫瘤組織吸入5 mL注射器內，肝臟穿刺并注入適量懸浮腫瘤組織，撤離針頭迅速用無菌脫脂棉按壓。小心將肝臟放回體內，縫合腹壁和表皮，傷口消毒置回籠盒，完成組織懸液PDOX模型制作。

1.6 肝癌PDOX模型的活體成像及腫瘤組織形態學觀察

肝癌PDOX模型建立4周后，對模型鼠進行腹腔注射NIRF染料IR-783(100 μmol/L，100 μL/只)，24 h后通過Caliper Lumina II小動物活體成像儀檢測模型鼠肝臟部位的腫瘤熒光信號。

解剖分離臟器和腫瘤分別進行成像，查看染料在小鼠臟器和腫瘤各部位的分布情況。最后將肝臟的腫瘤部分用4%多聚甲醛固定后，做組織病理學HE染色觀察。

1.7 肝癌PDOX模型PET/CT檢測

將肝臟部位有明確熒光信號的模型鼠送至西京醫院核醫學科進行小動物PET/CT檢測。模型鼠尾靜脈注射18F-FDG顯影劑150～200 μCi/只，注射后體內代謝1 h[10-11]，再使用異氟烷呼吸麻醉裸鼠后進行PET/CT 全身掃描； 掃描結束后3D圖像的構建利用Nuclinenano Scan軟件(Mediso公司)完成。

2 結果

2.1 肝癌 PDX腫瘤組織STR溯源檢測和組織形態病理結果

選取16個人源化STR位點聯合檢測。檢測結果顯示，該16個人源化位點均被檢出(圖1A)，可以確定該腫瘤的人源性。PDX組織H&E染色見圖1B，患者源發腫瘤和PDX進行比較，組織形態基本相似：細胞呈現多面體形；細胞核居中，大且圓，部分可見雙核，常染色質豐富，符合肝癌組織病理特征。肝癌特異性標志物AFP和CEA在原發瘤和移植瘤中均陽性表達，提示PDX模型較好地保存了原發瘤的遺傳和病理學特征。

2.2 肝癌PDOX模型的活體成像結果

圖2A顯示了小動物活體成像儀檢測的近紅外熒光染料IR-783成像結果。IR-783在24 h后在肝臟部位富集，熒光信號只是在腫瘤部位顯像，并不是整個肝臟區域均有熒光信號。

PET/CT檢測后麻醉處死模型鼠，取心、肝、脾、肺、腎等臟器組織進行近紅外熒光成像，圖2C中明顯可見IR-783染料主要富集在肝臟下緣的腫瘤部位，肝、腎等主要的代謝器官無富集。

制備的10只裸鼠肝癌PDOX模型，在成像結束后，將模型鼠安樂死后解剖發現，其中有兩只裸鼠接種的腫瘤生長在腹腔內壁，其余8只均生長在裸鼠的肝臟中。模型制備成功率為80%左右(8/10=80%)。

2.3 PET/CT評估PDOX建模狀況

PET/CT檢測結果如圖2B所示，除腦、心、肺、脊柱、膀胱顯示較強信號，這些部位顯示信號強是由于糖代謝水平高。此外，小鼠肝臟部位局部也可見明顯信號(見圖2B中紅色圓圈 處)，此信號部位即為肝腫瘤部位。

2.4 肝癌PDOX模型的組織形態觀察

組織塊直接植入后可見腫瘤組織生長于小鼠肝臟，表面可見光滑包膜，邊緣較清晰，未見彌漫生長，無可見轉移灶。組織病理形態觀察，腫瘤邊界較清晰，正常肝臟內腫瘤細胞浸潤不明顯，圖3中紅色箭頭所指區域即是原位移植的局限性生長的腫瘤。

圖3 肝癌PDOX模型腫瘤樣本的HE染色結果Fig.3 HE staining results of PDOX tumorsample from liver cancer

3 討論

成功建立的PDX模型必須確保與原發瘤的組織形態和遺傳特征相似。本研究使用肝癌患者新鮮腫瘤標本建立了皮下移植模型，分別從組織病理形態、腫瘤標志物和STR分型對移植瘤組織進行了分析，確認了與原發瘤的相似性，明確肝癌PDX模型的成功建立(見圖1)。進一步將PDX模型的瘤組織進行原位移植，提供與原發瘤相似的生長環境，有利于腫瘤特異性抗原的表達，維持腫瘤的異質性，采用HE染色的方法確認了組織形態的一致性(見圖3)。

與皮下移植瘤不同，肝臟原位移植瘤無法用肉眼觀察，只能等到動物發生明顯的體征后才能確認腫瘤的發生。而小動物分子影像技術則提供了有效方法對臟器內腫瘤進行有效評估，如MRI、PET和近紅外熒光(near infrared fluorescence，NIRF)活體成像。相比于前兩種方法，NIRF 活體成像特異性強，背景干擾小，方便直觀。常規NIRF技術通過將NIRF染料標記腫瘤特異性的靶向片段，使用光學設備檢測生物體內熒光信號，可實現對癌細胞的實時監測。PDX模型由于是瘤組織移植，無法進行特異性標記。我們實驗室與美國的Leland W.K. Chung教授合作發現一類七甲川菁(Heptamethine cyanine)近紅外熒光染料，如IR-783和MHI-148可特異性識別腫瘤細胞，不需標記探針可直接用于腫瘤模型的活體成像，具有成像和靶分子的雙重功能[11]。先前的研究中證實了該類染料具有多種腫瘤的靶向性，如前列腺癌、乳腺癌、腎癌等[10-12]，其靶向機制可能是有機陰離子轉運肽(organic anion-transporting peptides，OATPs)介導了該類染料的吸收[13]。本研究結果表明在原位移植30 d后，通過腹腔注射IR-783可以清晰觀察到肝臟部位熒光信號的聚集，進一步通過離體實驗確認肝臟腫瘤的發生(見圖2)。

小動物PET用于臟器內腫瘤檢測具有良好的靈敏度。本研究將功能代謝顯像(PET)和組織結構顯影(CT)兩種分子影像技術結合起來進行PET/CT雙模態成像系統。由于腫瘤細胞代謝旺盛，糖代謝水平高于正常肝組織，靜脈注射18F標記的氟代脫氧葡萄糖(fluorodeoxyglucose，FDG)。腫瘤對標記核素的高攝取通過PET/CT顯像可準確判斷腫瘤位置甚至腫瘤大小[14-15]。PET/CT顯像結果顯示，除了代謝旺盛器官如腦、心、脊柱等之外，在腹部肝區，明顯看到核素富集，輪廓清晰，區別于正常肝組織(見圖2B)。定期進行PET/CT檢測，可以準確判定腫瘤生長轉移等情況，實現對模型動物體內腫瘤的實時監測。

綜上所述，本研究中建立的肝癌PDOX模型，較好地保留了原發病人的腫瘤特異性和異質性，是進行肝癌發病機制研究以及治療藥物篩選研究的良好動物模型。