微生物氣溶膠與有害氣體聯合吸入動態暴露動物模型建立及評價*

唐 瑛 任小孟 陳雙紅 徐雄利 劉李娜 焦 勇

(海軍軍醫大學海軍醫學研究所，上海 200433)

大氣環境空氣污染對人群健康損害日益突出。呼吸系統是機體應對異源性可吸入污染物的第一道防御屏障，免疫應急和氧化應激在呼吸系統清除異源性污染中發揮重要作用[1-3]。然而過度應激又是導致呼吸系統功能性及器質性損傷的重要原因。呼吸系統結構和功能損傷影響其防御能力，從而加重空氣污染物進一步致機體多臟器甚至系統性損害。因此，呼吸系統對異源性污染刺激的應激及響應能力，對防御空氣污染致人群健康損害有重要意義。

甲醛(Formaldehyde, FA)是現代建筑中典型的代表性化學性污染物，廣泛地存在于塑料制品、樹脂和建筑材料中，也是家庭常用品如食品防腐劑、化妝品、消毒劑和殺菌劑的組分。此外，FA也是某些自然活動(如火災)和人類活動(如吸煙和汽車燃料燃燒)的副產物。FA作為人類致癌物，已被確定可引起鼻咽癌并可能引起白血病，FA暴露還可引起其它多種健康問題如急慢性毒性、免疫毒性、造血毒性、生殖毒性、遺傳毒性等[2]。

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa, PAO)為廣泛存在于自然環境的條件致病菌，是導致急慢性呼吸系統感染的典型革蘭陰性桿菌。其細胞壁組成成分脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)，可導致全身炎癥反應綜合征、內毒素休克、敗血癥、甚至多器官功能障礙綜合征，是制作急性肺損傷動物模型有效成分[1]。

FA和PAO是現代建筑大氣環境典型空氣污染物，大氣環境中化學與生物污染物對呼吸系統的疊加損害逐漸被認識，但系統性研究較少。因此，本文采用動態吸入染毒系統，研究建立生化氣溶膠聯合暴露肺損傷動物模型，并從組織結構、應激損傷因子和損傷效應因子三個層面進行模型有效性評價。該模型為進一步開展大氣環境主要污染物長期低劑量暴露對人群健康風險評估實驗研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型建立

動物暴露裝置為HOPE-MED 8050型動態氣溶膠染毒暴露系統(天津合普工貿有限公司)。分析純FA溶液(國藥集團)，加入到標準配氣發生器，恒定溫度至(25±1)℃，FA自動分析檢測儀監測暴露艙內甲醛的動態濃度，調節進氣及載氣流量，維持艙內穩態濃度為(3.4±0.3) mg/m3。PAO1凍存甘油菌按常規條件復蘇、活化、傳代培養。以傳至3～6代細菌制備微生物氣溶膠發生懸液。預實驗每隔10 min監測暴露艙內微生物濃度，確定試驗時細菌懸液的初始濃度、氣溶膠發生器的進液流量及動態混合氣流量。最終控制暴露艙內細菌的穩態濃度至0.5～1×107cfu/m3。

8周齡雄性Wistar大鼠31只(中科院實驗動物中心)，體質量(180±10 g)。隨機分為正常對照組(7只): 普通室內環境中飼養生長28 d；FA吸入暴露組(8只)：艙內(3.4±0.3) mg/m3穩定暴露濃度，每天吸入2 h，連續吸入暴露28 d；PAO1氣溶膠吸入暴露組(8只)：PAO1氣溶膠穩態濃度(0.5～1)×107cfu/m3，每天吸入2 h，連續吸入暴露28 d；FA與PAO1氣溶膠聯合吸入暴露組(8只)：每天FA(3.4±0.3) mg/m3暴露2 h，暴露結束后換新鮮空氣45 min, PAO1(0.5～1)×107cfu/m3暴露2 h, 連續暴露28 d。

1.2 動物處理及取材

第28 天大鼠暴露吸入試驗結束后2 h進行麻醉。不同組別大鼠用5%水合氯醛 0.3 mL/ 100 g 腹腔注射麻醉。仰臥固定，開胸，暴露胸、腹腔。真空采血管抽取血樣本。并迅速分離完整的支氣管和肺，置于4%多聚甲醛充分混合固定，部分肺葉置液氮保存。固定組織按常規石蠟切片制作程序進行包埋，切片,用HE染色、革蘭氏染色和Tunel原位細胞凋亡檢測。

1.3 樣本檢測

1.3.1切片染色：石蠟切片常規脫蠟，按《組織學與胚胎學實驗技術》操作[4]，進行常規蘇木素/伊紅染色(國藥集團)，觀察肺組織的形態學變化。按《臨床微生物學手冊》操作[5]，進行Gram 染色(上海科瑪嘉生物技術公司)，觀察各級支氣管及肺泡腔細菌殘留情況。Tunel DAB原位顯色法檢測肺組織細胞凋亡情況，操作參照試劑盒說明(碧云天生物技術公司)。

1.3.2血清學指標檢測: 不抗凝自動采血管采5 mL血樣，自然凝固15～20 min, 2 000 r/min離心10 min，收集血清樣本，4 ℃保存并送至解放軍411醫院檢驗科進行IgM 含量和 SOD活性的定量檢測。用 ELISA 法測定血清細胞因子(IL-1β、IL-8、TNF-α、CC10)，用 bio-rad 型全自動酶標儀測定光密度A值。大鼠血清學指標檢測試劑盒分別購自上海信裕生物科技公司及南京建成生物工程研究所。

1.4 統計方法

2 結果

2.1 動物模型肺形態及組織結構損傷比較

對大鼠肺臟大體特征觀察顯示：正常對照組大鼠肺臟濕潤、粉紅色；AF實驗組肺臟體積增大、顏色現蒼白；PAO實驗組肺臟暗紫紅色淤血狀、組織彈性差；聯合暴露實驗組肺臟灰白、有明顯實變特征。石蠟包埋切片HE染色后，每張切片在×400顯微鏡下隨機選擇10個視野觀察。結果顯示：與對照組隨機視野相比，3組實驗組肺組織都有不同程度間質充血水腫、肺泡間隔增寬，肺組織出現淋巴細胞、中性粒細胞和巨噬細胞浸潤。炎性細胞浸潤以聯合暴露組最明顯、PAO氣溶膠暴露組次之，AF暴露組較輕。聯合暴露組部分肺泡上皮細胞壞死脫落、內皮層缺損，部分肺泡腔內有粉紅色炎性滲出(圖1)。

圖1 大鼠肺及其組織石蠟切片 HE染色(×400)注：CO28:對照組；AF28:AF吸入暴露組；PAO28:PAO吸入暴露組；AF&PAO28聯合暴露組Fig.1 HE staining of rat lung paraffin embedding tissue HE(×400)Note: CO28: Control group; AF28: AF inhalation exposure group; PAO28:PAO1 inhalation exposure group;AF&PAO28: AF and PAO1 co-exposure group

圖2 大鼠支氣管、肺組織石蠟切片細胞凋亡Tunnel原位檢測(×400)注：CO28:對照組；AF28:AF吸入暴露28天實驗組；PAO28:PAO1暴露28天實驗組；AF&PAO28 AF和PAO1聯合暴露28天實驗組Fig.2 In situ detection apoptosis of rat bronchial and lung paraffin sections tissues by Tunnel(×400)Note: CO28: Control group; AF28: AF inhalation exposure group; PAO28:PAO1 inhalation exposure group;AF&PAO28: AF and PAO1 co-exposure group

2.2 動物模型肺、支氣管組織細胞損傷比較

肺及支氣管石蠟切片經Tunnel原位染色，凋亡細胞核呈棕色，正常細胞核不顯色。每張切片在400倍顯微鏡下隨機選擇10個視野進行觀察。結果顯示：對照組支氣管、肺組織細胞核空染、不著色；AF暴露組、PAO1氣溶膠暴露組，支氣管、肺組織切片不同視野中均見明顯胞核棕染的凋亡小體；與對照組及單因素暴露組比較，聯合暴露組支氣管、肺組織切片不同視野棕染凋亡小體數量顯著增多(圖2)。

2.3 動物模型免疫應急、氧化應激指標觀察

分別對大鼠血清免疫應激指標IgM水平、氧化應激指標SOD活性檢測結果顯示：與對照組相比，3實驗組血清IgM均值升高，以AF&PAO28組增高最顯著，PAO28組次之，AF28組增加無顯著性意義。各實驗組血清SOD活性增加明顯，與對照組比較都有顯著性差異(P<0.05),其中聯合暴露組較AF暴露組和PAO28暴露組升高更顯著(P<0.05)，見表1。

2.4 動物模型免疫及氧化應激損傷生物效應指標觀察

分別檢測大鼠肺應激損傷代表性標志物TNF-α、IL-1β(α亞型主要位于胞質)和IL-8、以及損傷修復代表性標志物CC10，結果顯示：與其它3組比較，AF&PAO28組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-8水平明顯升高(P<0.05)，CC10水平明顯降低(P<0.05)。AF28和PAO28組分別與對照組比較差異顯著(P<0.05)，見表2。

表1 不同暴露條件下大鼠血清IgM/SOD的檢測Table 1 Detection of serum IgM/SOD in rats under

注：CO28:對照組；AF28:AF吸入暴露28天實驗組；PAO28:PAO1暴露28天實驗組；AF&PAO28 AF和PAO1聯合暴露28天實驗組

Note：＊AF&PAO28vs. PAO28 and AF28 and CO 28 (P<0.05)；﹟PAO28vs. AF28 / CO 28 (P<0.05)；※AF28vs. CO 28(P<0.05)

表2 吸入暴露后大鼠血清炎性效應因子水平比較Table 2 Comparison of serum inflammatory factors in

注：CO28:對照組；AF28:AF吸入暴露28天實驗組；PAO28:PAO1暴露28天實驗組；AF&PAO28 AF和PAO1聯合暴露28天實驗組

Note：aAF&PAO28vs. PAO28 /AF28 / CO 28 (P<0.05)；bPAO28vs. CO 28 (P<0.05)；cAF28vs. CO28 (P<0.05);

3 討論

化學有機物與微生物氣溶膠是大氣環境主要污染物，呼吸系統和心肺疾病的發病率、人群死亡率與長期低劑量空氣污染物暴露正相關[6-9]。呼吸系統是空氣污染物進入機體的第一道防御屏障，肺組織為清除異源性污染，炎性細胞被激活，釋放大量抗炎和促炎因子啟動防御反應。研究表明，肺組織在外來物質的刺激下，肺泡巨噬細胞大量聚集產生活性氧，自由基產生后引起細胞脂質過氧化、蛋白質氧化及DNA損傷，造成細胞損傷，甚至凋亡[9]。因此，肺組織為清除異源性污染，炎性細胞被激活、釋放大量抗炎和促炎因子啟動防御反應。然而，過度的防御應激即啟動了炎癥過程、也促發了炎癥發展，造成肺部損傷。

本研究證實經28 d 吸入暴露，AF暴露組和PAO1暴露組都能明顯誘導大鼠肺組織的炎性細胞聚集、肺組織呈現水腫等病理改變。聯合吸入暴露進一步加劇大鼠肺組織結構損傷效應，伴有明顯的肺泡上皮細胞脫落等明顯結構性損傷特征，細胞凋亡現象明顯。以上結果表明AF與PAO1聯合暴露，誘導了疊加損傷效應。血清學指標顯示，聯合暴露組大鼠血清IgM水平明顯升高、血清SOD活性明顯增強。IgM是機體遭受微生物感染后產生的免疫球蛋白、半衰期短，是機體近期遭受微生物感染的免疫應激指標，血清SOD活性則是指示機體氧化應激狀態的指標。以往研究表明，甲醛可通過氧化應激途徑誘發呼吸系統炎性損傷；而微生物分解物及其次級代謝產物，如：脂多糖、β1-3-葡聚糖等，既是強免疫應激源也是強氧化應激源。因此，本研究中聯合暴露組大鼠血清氧化應激和免疫應激指標水平增加，進一步指示甲醛與微生物氣溶膠聯合暴露產生的疊加損傷效應導致大鼠機體處于高應激損害狀態。

TNF-α、IL-1β(α亞型主要位于胞質)和IL-8是代表性促炎因子指示機體炎性損傷，CC10肺組織炎性損傷代表性修復標志物[6-8]。TNF-α是肺泡巨噬細胞吞噬異物后釋放出的早期前炎性因子。TNF-α 被激活后不僅自身可以誘導細胞凋亡，還可進一步刺激巨噬細胞、成纖維細胞和上皮細胞等釋放細胞因子及黏附分子，如 IL-1、IL-8等，這些黏附因子及細胞因子使中性粒細胞、巨噬細胞、單核細胞、多形核白細胞等各種炎癥細胞聚集，產生更多的細胞因子，形成級聯放大反應，加重了肺組織的損傷。機體炎性損傷是一個整體反應,促炎和抗炎細胞因子之間動態平衡就是機體損傷和修復的動態過程。既往的研究表明，TNF-α、IL-1α、IL-1β和 IL-8 等促炎因子是肺損傷的物質基礎，也是急性暴露肺損傷模型中的炎性反應觀察的有效指標。

綜上所述，甲醛及微生物氣溶膠聯合暴露促進了肺部組織結構及細胞損傷，導致肺組織細胞對異源污染物清除能力的減弱，從而增加了異源性污染對機體的侵害風險，誘使機體出現強防御應激狀態，而過度的應激狀態又可激活其他多途徑的生理效應，加劇機體健康損害程度。這一研究結果提示，空氣環境中化學及生物有害因素復合暴露能增加機體的職業健康損害風險。因此，進行環境主要有害因素職業性暴露損傷的早期健康風險評價、并采取防御措施保護健康很有必要。