姜黃素預處理對干熱環境熱射病大鼠心肌保護作用的研究*

馬 娜 李佳佳 周 靜 董 翔 路 軍 唐 軍李建瑛 是文輝 許 琴 張東輝 宋來陽 劉江偉

(新疆軍區總醫院新疆特殊環境醫學重點實驗室，烏魯木齊 830000)

中暑是熱應激的嚴重形式，是一種威脅生命的嚴重疾病，臨床上定義為核心體溫超過40 ℃，機體溫度調節失敗，中樞神經系統異常出現抽搐、昏迷、譫妄等癥狀[1]，而熱射病是中暑的嚴重類型。高熱可引起全身炎癥反應導致多器官功能障礙或衰竭，包括在大腦、肺、心臟、胃腸道、腎的出血和壞死[2]。我們前期研究表明，沙漠干熱環境中暑可引起大鼠心肌損害[3-4]。姜黃素(curcumin，CUR)是姜黃中提取的一種植物多酚化合物[5]，可通過減輕氧化應激、炎癥、細胞凋亡和纖維化來防止心肌損傷，姜黃素長期以來一直是世界范圍內的一種調味品和一種傳統藥物。有研究發現,姜黃素通過發揮抗氧化及抗凋亡作用提高心肌功能，降低心臟功能損害[6]。姜黃素是否能對熱射病大鼠的心肌損傷具有保護作用，目前國內外尚未見文獻報道，本研究采用姜黃素預處理，通過觀察中暑大鼠心肌病理學、超微結構變化及心肌酶CK、CK-MB、LDH水平的變化，探討了姜黃素對心肌損傷的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗環境

SPF級雄性SD大鼠50只，購自新疆維吾爾自治區實驗動物研究中心，生產合格證號[SCXK(新)2011-0001]，體質量220～260 g。動物飼養在[溫度：(21±1)℃，相對濕度：(45±5)%]SPF級動物實驗室，自由攝取食水，使用許可證編號[SYXK(新)2016-0003]。實驗方案獲新疆軍區總醫院動物倫理委員會批準。實驗取材等相關工作在新疆軍區總醫院實驗動物科屏障動物實驗設施進行[SCXK(新)2011-0003]。并按照實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 儀器與試劑

西北地區特殊環境人工實驗艙(新疆軍區總醫院研制)，電子稱(上海儀器廠)，分析天平(上海儀器廠)，全自動生化儀，電子顯微鏡，BI2000圖像分析系統。姜黃素購自日本化成株式會社，羧甲基纖維素鈉購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 方法

將SD大鼠放置在SPF室內適應性飼養1周，溫度(25±2)℃，相對濕度40%～50%，每12 h明暗交替。隨機將大鼠分為5組：①常溫對照組(Normal control)，生理鹽水灌胃；②干熱對照組(Dry-heat control)，生理鹽水灌胃；③低劑量姜黃素預處理組(L-cur)，50 mg/kg姜黃素+5%羧甲基纖維素鈉溶液配置成混懸液灌胃；④中劑量姜黃素預處理組(M-cur)， 100 mg/kg姜黃素+5%羧甲基纖維素鈉溶液配置成混懸液灌胃；⑤高劑量姜黃素預處理組(H-cur)，200 mg/kg姜黃素+5%羧甲基纖維素鈉溶液配置成混懸液灌胃；各個實驗組連續灌胃7 d，大鼠自由攝食飲水(均經滅菌處理)。在實驗的第8天，除常溫對照組外，其余4組大鼠轉移至由新疆軍區總醫院自行研制的人工氣候艙(西北特殊環境人工實驗艙)內，環境溫度(41±0.5) ℃，相對濕度(10±1)%，禁食禁水。復制以前建立的熱射病大鼠模型[4]，在實驗開始后150 min，大鼠以3%戊巴比妥腹腔麻醉后處死，取下腔靜脈血液保存并離心15 min，-80 ℃保存，全自動生化檢測儀檢測血清CK、CK-MB、LDH水平。HE染色：取下腔靜脈血液后，切取適當大小心臟組織，5%生理鹽水沖洗后放入新鮮配制的4%甲醛中固定，進行石蠟包埋和切片，HE染色后觀察心臟病理變化；電鏡：切取心臟心尖部大小約1.5 mm x1.5 mm x1.5 mm 大小心臟組織，立即放入新鮮配制的2.5%的戊二醛中，將固定后的心肌組織送新疆醫科大學，用高倍透射電子顯微鏡觀察心肌結構，拍照并進行分析。

1.4 統計方法

2 結果

2.1 姜黃素對中暑大鼠血清心肌酶的影響

大鼠血清心肌酶CK、CK-MB、LDH結果顯示，NC組、姜黃素預處理各濃度組與DHC組之間有顯著性差異(P<0.01)；姜黃素預處理各濃度組之間有顯著性差異(P<0.01)，呈梯度遞減。見圖1。

圖1 姜黃素對中暑大鼠血清CK、CK-MB、LDH的影響注：a：與DHC組比較， P<0.01；b：與L-cur組比較P<0.01；c：與M-cur組比較P<0.01Fig.1 Effect of curcumin on serum CK, ck-mband LDH in rats with heat strokeNote: a: compared with DHC group, P<0.01;B: compared with thel-cur group, P<0.01;C: compared with the m-cur group, P<0.01

2.2 HE染色光鏡觀察

NC組心肌肌束排列整齊，DHC組光鏡下部分心肌組織細胞壞死斷裂，并可見中性粒細胞浸潤；L-cur組可見心肌細胞間少量的中性粒細胞并有輕微的血管擴張；M-cur組心肌組織細胞水腫較嚴重，部分細胞核腫脹或濃縮或消失；H-cur組心肌細胞間有少量的嗜酸變。姜黃素預處理組隨著姜黃素濃度的增加，其損傷逐漸減輕，見圖2。

圖2 姜黃素預處理對熱射病大鼠心肌組織病理改變(HE×40)注：A：常溫對照組(NC)；B：干熱對照組(DHC)；C：姜黃素50 mg/kg(L-cur)；D：姜黃素100 mg/kg(M-cur)；E：姜黃素200 mg/kg(H-cur)Fig.2 The pathological changes of myocardial tissue in rats with the pretreatment of curcumin (HE×40)Note: A: normal temperature control group (NC);B: dry heat control group (DHC);C: curcumin 50 mg/kg(L-cur);D: curcumin 100 mg/kg(M-cur);E: curcumin 200 mg/kg(H-cur)

2.3 電鏡觀察心肌細胞超微結構

NC組心肌細胞形態完整，肌纖維排列整齊，線粒體排列整齊，Z線清晰；DHC組心肌細胞線粒體腫脹，線粒脊結構紊亂，部分肌絲斷裂，部分線粒體排列不規則；H-cur組心肌細胞線粒體結構較完整，線粒體有增生的現象，胞核膜清晰，核仁數量較多，Z線較為清晰，排列較為規則，見圖3。

3 討論

熱射病是一個威脅生命的疾病,其特征是40 ℃以上的核心體溫升高,導致多器官衰竭,如循環沖擊和肝功能衰竭以及心臟衰竭[7]。它是引起全身炎癥、血管內凝血和組織病變的一種全身炎癥反應綜合征。由于高熱引起熱耗散導致體表血管擴張，使流入內臟器官的血液減少，如治療不及時，可使多臟器衰竭導致生命體征完全消失[8]。

本研究發現，姜黃素預處理對于干熱環境下不同程度中暑的大鼠模型心肌損傷均具有預防作用，心肌酶CK、CK-MB和LDH存在于心肌和骨骼肌等組織細胞的細胞質和線粒體中，它們在心臟病變或受損時表現出不同程度的升高，干熱對照組血清中CK、CK-MB、LDH 的活力異常升高，表明了環境高溫導致心肌損傷。本次研究中姜黃素高劑量組心肌酶CK、CK-MB、LDH與其他組對比有明顯差異，隨著姜黃素劑量升高，高心肌酶的水平明顯降低。另外，HE染色光鏡觀察及電鏡觀察發現，DHC組大鼠在熱應激情況下組織細胞病變嚴重，姜黃素干預組明顯好轉，說明姜黃素有很好的保護作用。

心臟是機體循環系統的始動器官，在熱應激機體自我調節下起非常重要的作用。心血管研究的一個重要方面是新藥物的開發和現有藥物對缺血心肌保護、心肌血管生成的促進以及心肌梗死后心臟重塑和功能改善的研究[9]。姜黃素是一種廣泛使用的藥物，已成為心血管研究領域的研究對象。 Lu等[10]研究發現，心肌梗死與壞死、凋亡有關，并引起組織和器官功能紊亂。姜黃素對缺血和缺氧心肌有保護作用,增加bcl-2和PPAR-γ表達,抑制細胞凋亡和NF-κB表達,減少炎癥。目前認為姜黃素可以通過減輕氧化應激、炎癥、細胞凋亡和纖維化來防止心肌損傷。 Xiao等在體內和體外進行了一系列的實驗研究，以評估膠原沉積、CF增殖和遷移、基質金屬蛋白酶(MMP)誘導的ECM降解和SIRT1表達。研究結果顯示，對心肌纖維化有一定的保護作用，這部分是由SIRT1激活引起的[11]。 Zhou等研究結果表明姜黃素有助于降低細胞凋亡和自噬水平，通過上調Bcl-2表達量，下調Bax和beclin-1的表達水平提高細胞活力。此外，姜黃素抑制H9c2細胞中BNIP3和SIRT1的表達，通過降低細胞凋亡和自噬水平，證明了姜黃素對心肌H/R損傷的保護作用[12]。 Liu等發現并證明姜黃素的抗氧化和抗凋亡作用，可以改善由于心肌梗死導致的心肌功能衰弱和心臟的損害。姜黃素誘導磷酸化，在JAK2和STAT3中，上調心肌Bcl-2/Bax表達使caspase-3失活。姜黃素對于誘導的再灌注損傷的心臟具有保護作用，使其用于限制心肌梗死和細胞凋亡[13]。

本研究首次將姜黃素應用于沙漠干熱環境熱射病大鼠的心肌保護研究之中，研究發現，姜黃素對沙漠干熱環境下中暑大鼠心肌具有保護作用且呈現劑量依賴性，以高濃度效果最好。姜黃素作為傳統藥物，具有高效、副作用小等特點，在沙漠干熱環境下預防心肌損傷具有潛在的臨床應用價值。