基于配方配伍藥效學及正交試驗優選復方哈蟆油片配方組成及工藝參數

賈學嬌，孫敬蒙，郭 毅，盧美彤，張煒煜

（長春中醫藥大學，長春 130117）

慢性疲勞綜合征可歸屬于中醫學“虛勞”范疇。據WHO調查[1-2]顯示，全球有35%以上的人處于疲勞狀態，而中年男性占比達60%。促進疲勞的恢復和延緩疲勞的發生一直是運動醫學、保健醫學等學科的研究熱點。黃芪、紅景天、哈蟆油均為衛生部批準的藥食兩用藥材。通過文獻查閱及史料記載證明，黃芪[3-7]、紅景天[8-11]、哈蟆油[12-15]3味藥材均具有較好的緩解體力疲勞作用。筆者依據2015版《中華人民共和國藥典》確定用量適用范圍，采用動物配方配伍藥效實驗優選配伍及用量，通過正交試驗優選復方哈蟆油片的提取工藝，從而為成型工藝及大生產提供參數。

1 儀器與材料

1.1 材料 紅景天（購于亳州萬草堂中藥飲片有限公司，批號：141220）、黃芪（購于亳州萬草堂中藥飲片有限公司，批號：140601）、哈蟆油（購于長白山生態食品有限公司，批號：150501）；紅景天苷（中國食品藥品檢定研究院，批號：110818-201407）；黃芪甲苷（中國食品藥品檢定研究院，批號：110781-200613）；正丁醇、氨水為分析純；甲醇、乙腈均為色譜純。

1.2 儀器與器材 Agilent 1200 Series高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）； AR2140型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；JA5301N電子精密天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）KQ2200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH.S21-Hi6電熱恒溫水浴鍋（北京市長源實驗設備廠）；電子稱、游泳箱（自制），鉛皮等。

1.3 實驗動物 SPF級ICR雄性小鼠100只，體質量18～22 g，購于長春億斯實驗動物技術有限責任公司，合格證號：SCXK（吉）-2016-0003，實驗前適應性飼養1周。

1.4 配方配伍藥效試驗提取物的制備1.4.1 黃芪-紅景天 稱取黃芪、紅景天共62.1 g，加入8倍于藥材量水煎煮3次，1.5 h/次，過濾，合并濾液，濃縮體積至120 mL以下，放冷，加入5.355 g黃芪細粉，混勻，用生理鹽水定容配置成實驗用高、中、低組濃度的混懸液，即得。

1.4.2 黃芪-哈蟆油 稱取黃芪48.8 g，加入8倍于藥材量水煎煮3次，1.5 h/次，過濾，合并濾液，濃縮體積至120 mL以下，放冷，加入5.355 g黃芪細粉及1.47 g哈蟆油細粉，混勻，用生理鹽水定容配置成相應濃度的混懸液，即得。

1.4.3 黃芪-紅景天-哈蟆油 稱取黃芪、紅景天共62.1 g，加入8倍于藥材量水煎煮3次，1.5 h/次，過濾，合并濾液，濃縮體積至120 mL以下，放冷，加入5.355 g黃芪細粉及1.47 g哈蟆油細粉，混勻，用生理鹽水定容配置成相應濃度的混懸液，即得。

1.5 方法 按照《中華人民共和國藥典》將人體服用劑量換算成小鼠實驗劑量，分高、中、低9個劑量組；A組：黃芪+紅景天（1.51 、1.18、1.015 g/kg），B組：黃芪+哈蟆油（0.92、0.885、0.867 5 g/kg），C組：黃芪+紅景天+哈蟆油（1.58、1.22、1.032 5 g/kg），其中高、中、低劑量分別是臨床用量的2、1 、0.5 倍[16-17]。

試驗設黃芪-紅景天（A）、黃芪-哈蟆油（B）、黃芪-紅景天-哈蟆油（C）3個藥物配伍組，每組30只。每組分別設3個亞組（每個亞組10只），另取10只動物作為陰性對照組。除陰性對照組給予等體積生理鹽水外，其余各組動物分別按相應濃度灌胃給予受試藥，給藥體積20 mL/kg，連續給藥30 d。每周稱重1次，按體質量及時調整給藥濃度。

1.5.1 力竭游泳試驗 末次給藥30 min后，稱重、將小鼠尾根部負荷5%體質量的鉛皮并置于游泳箱中游泳。水箱深度高于30 cm，水溫（25 ±1）℃，記錄小鼠自游泳開始至死亡的時間，即小鼠負重游泳時間[18]。

1.5.2 給藥劑量的確定 小鼠灌胃給藥劑量按人體與動物的體表面積比率換算確定劑量，人體質量按70 kg，小鼠按20 g，根據Mech-Rubter公式計算。A = K·W 2/3/1 000（體質量以g計算），K為常數，小鼠為9.1。

1.5.3 統計學方法 實驗數據使用SPSS 20.0軟件進行統計學處理，采用χ2分析，所有數值均以均數±標準差（x± s ）表示。

1.5.4 正交試驗設計 采用 L9（34）正交試驗設計[19]，以黃芪甲苷及紅景天苷[20]為考察指標，考察加水倍量，提取時間，提取次數對功效成分的影響，見表1。

表1 正交試驗提取因素水平表

根據表1擬定 L9（34） 9組實驗，每組實驗稱取黃芪67.5 g，紅景天30 g，按上表添加相應倍量水至一定量，浸泡至無白心后，水煎，過濾，濃縮至150 mL，濃縮液備用。

1.5.5 黃芪甲苷和紅景天苷含量測定

1.5.5.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，，紅景天苷流動相為乙腈-水（10:90）；檢測波長為275 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃ ，進樣量 10 μL。黃芪甲苷以乙腈-水（32:68）為流動相；蒸發光檢測器。 理論塔板數按丹酚酸 B峰計算應不低于2 000，按黃芪甲苷計算應不低于4 000。

1.5.5.2 對照品溶液的制備 紅景天苷對照品溶液：取紅景天苷對照品約4 mg，精密稱定，置2 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

黃芪甲苷對照品溶液：取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每l mL含0.5 mg的溶液，即得。1.5.5.3 供試品溶液的制備 供試品溶液（測定紅景天苷）：稱取提取物細粉約0.1 g，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加甲醇使之溶解，超聲提取30 min；加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，即得。

供試品溶液（測定黃芪甲苷）：稱取提取物細粉約0.5 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘渣加水10 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次， 40 mL/次，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水5 mL使溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂柱（內徑為1.5 cm，柱高為12 cm），以水50 mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。稀釋至一定濃度，備用。

1.5.6 方法學考察

1.5.6.1 標準曲線的建立 精密量取紅景天苷對照品溶液 0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64 mL，置2 mL量瓶中加甲醇稀釋至刻度，制成紅景天苷標準系列溶液，黃芪甲苷對照品溶液0.033 3、0.05、0.1、0.2、0.25、0.5、1 mL分別置1 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成不同濃度的黃芪甲苷對照品溶液。依次注入液相色譜儀測定，記錄峰面積，紅景天苷以色譜峰面積（Y）為縱坐標，對照品濃度（X）為橫坐標，黃芪甲苷以對照品色譜峰面積（A）的對數lnA為縱坐標，對照品含量的對數lnC為橫坐標，繪制標準曲線，得紅景天苷及黃芪甲苷回歸方程，分別為Y = 2 330.7 X - 5.047 3，r = 0.999 8；Y = 1.475 3 X+4.780 3，r = 0.999 5。結果表明，紅景天苷濃度在0.02～0.67 mg/mL范圍內線性關系良好，黃芪甲苷濃度在18.67～560 μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

1.5.6.2 方法學驗證 本實驗對紅景天苷及黃芪甲苷的重復性、儀器精密度、穩定性、加樣回收率進行了考察。結果表明，紅景天苷重復性RSD為1.35% ，黃芪甲苷重復性RSD為2.18%，表明該方法重復性良好。紅景天苷儀器精密度RSD為1.74%，黃芪甲苷儀器精密度RSD為1.55%，表明儀器精密度良好；紅景天苷穩定性RSD為1.17%，黃芪甲苷穩定性RSD為2.69%，表明測定方法室溫狀態下穩定性良好。紅景天苷平均回收率為100.43%，RSD為1.13%，黃芪甲苷平均回收率為100.56%，RSD值為2.09%，表明本試驗方法準確可行。

2 結果

2.1 復方哈蟆油片配方對小鼠體質量變化的影響 見表2。

表2 復方蛤蟆油片配方對小鼠體質量變化的影響（n = 10）

2.2 復方哈蟆油片配方對小鼠負重游泳時間的影響 見表3。

表3 復方蛤蟆油片配方對小鼠負重游泳時間的影響（n = 10）

2.3 正交試驗結果及方差分析試驗結果 正交試驗結果表明，各因素主次順序為：提取次數＞提取時間＞加水倍量，且提取次數有顯著性影響（P＜0.05）；由直觀分析示，A因素中A2＞A3＞A1，故選擇A2；C因素中C3＞C2＞C1，故選擇C3；B因素中B3＞B2＞B1，B2和B3差異不明顯，在A2、C1條件下，將復方提取時間1.5 h與2 h綜合進行比較，差異無統計學意義，為了保證提取完全，節省時間和成本，綜合考慮提取時間為1.5 h，即B2；因此確定最佳工藝為A2B2C3，即加8倍水量，提取1.5 h/次，提取3次。

3 小結

確定通過文獻查閱及探索，最終色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水（10:90）為流動相；柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，進樣量10 μL。復方哈蟆油片由黃芪、紅景天、哈蟆油所組成，所用中藥均為衛生部批準的藥食兩用藥材，諸藥同用，能氣血雙生，平調陰陽，緩解疲勞，正氣充足，祛病延年。本研究結果表明，連續給予小鼠不同劑量的復方哈芪片混合提取物后，緩解體力疲勞的作用隨劑量增加而逐漸增強，以黃芪+紅景天+哈蟆油組的效果更明顯。