“調臟通絡”電針對糖尿病周圍神經病變大鼠坐骨神經細胞凋亡的影響

張麗穎，黃海鵬，潘 鴻，鐘 禎，馬詩棋，王宇峰，董 理，王洪峰

（長春中醫藥大學，長春 130117）

糖尿病周圍神經病變（DPN）是糖尿病的主要并發癥，發生率可高達85%以上[1]。臨床以肢端麻木、感覺異常、痛覺過敏、觸覺異常、腱反射減弱或消失為主要癥狀[2-4]。近年來，糖尿病患者的數目急劇攀升，預計到2035年將增加至5.92億[5]。DPN 發病機制復雜，研究[6-7]顯示，代謝紊亂與血管受損為重要因素，其他如神經營養因子、免疫因素、氧化應激等也至關重要。 目前，西醫治療DPN主要采用控制血糖加以改善微循環、緩解疼痛、營養神經的藥物[8-9]。相比而言，中醫治療尤其是電針療法在改善DPN癥狀方面日益凸顯其優勢。電針治療DPN 具有療效確切、經濟方便、安全、沒有藥物不良反應以及從整體、多途徑、多靶點發揮鎮痛及調節血糖作用等諸多優點[10-11]。同時越來越多的研究[12-13]提示，內質網應激導致細胞凋亡是DPN發生發展的重要機制之一。因此，本文將從DPN細胞凋亡的角度開展研究，結合首創的“調臟通絡”電針法，以STZ誘導的DM大鼠為模型，來探討本法對糖尿病周圍神經病變大鼠坐骨神經細胞凋亡的影響。現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級成年雄性SD大鼠86只，體質量（200±20）g，由遼寧長生生物技術有限公司提供，動物許可證編號：SCXK（遼）2015-0001；溫度21～25 ℃，濕度40%～70%，每日光照12 h，噪音＜60分貝，以大鼠維持飼料分籠飼養。

1.2 主要試劑與儀器 鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma公司）；甲鈷胺膠囊（江蘇德源藥業有限公司，規格：0.5 mg）；One touch two 血糖儀和血糖試紙條（羅氏）；TUNEL試劑盒（英國Abcam公司）。

1.3 動物造模、分組與治療

1.3.1 動物造模與分組 大鼠適應性喂養1周，實驗前測空腹血糖1次，所有大鼠空腹血糖均＜5.8 mmol/L，將86只實驗動物隨機分為正常對照組（n = 5）和造模組（n = 81）。造模組大鼠在造模前禁食（不禁水）12 h后稱重，按50 mg/kg劑量一次性腹腔注射1%STZ溶液，制作DM模型，造模成功后，將成模大鼠隨機分為電針干預組、藥物干預組、模型對照組。

1.3.2 干預方法 1）電針干預組：取雙側肺俞、脾俞、腎俞、合谷、足三里、三陰交、太沖，予以調臟通絡電針進行干預，同時以同側肺俞-腎俞、三陰交-太沖為電針連接對穴。腧穴定位參照國家十二五規劃教材《實驗針灸學》（北京：中國中醫藥出版社，2012）中大鼠針灸穴位圖譜進行定位，肺俞：第3胸椎下兩旁肋間；脾俞：第12胸椎下兩旁肋間；腎俞：第2腰椎下兩旁；合谷：前肢第1、2掌骨之間；太沖：第1、2跖骨間；足三里：膝關節后外側，在腓骨小頭下約5 mm處，在脛、腓骨間隙中；三陰交：后肢內踝尖直上10 mm。肺俞、脾俞、腎俞采用0.5寸毫針，直刺6 mm；合谷采用0.5寸毫針，直刺1 mm；太沖采用0.5寸毫針，直刺1 mm；足三里（后三里）采用0.5寸毫針，直刺7 mm；三陰交采用0.5寸毫針，直刺5 mm。選用華佗牌SDZ-V型電針儀，以同側的肺俞-腎俞、三陰交-太沖為電針連接對穴，取疏密波（頻率比為1:5），設置疏波頻率為3 Hz，強度以刺激部位肌肉輕微收縮且大鼠能夠耐受為度，1次/d，20 min/次，6次為1療程，療程間休息1 d，連續干預12周。2）藥物干預組：予以甲鈷胺灌胃，20 mg/（kg·d），1次/d，連續干預12周。3）模型對照組：造模成功后，同等條件下飼養，不予任何特殊處置。4）正常對照組：未經造模，同等條件下飼養，僅作對照。

1.4 檢測指標

1.4.1 檢測血糖 于DM造模后的第3、7天分別進行尾尖采血，用血糖儀隨機檢測各組大鼠的血糖濃度。

1.4.2 TUNEL法檢測大鼠細胞凋亡 切片常規脫蠟，蛋白酶K消化處理后，按照TUNEL試劑盒的使用說明操作，經DAB發色、蘇木精染核，脫水、封片后，在熒光顯微鏡下觀察。實驗結果：光鏡下觀察凋亡的細胞核呈現棕色，細胞核被蘇木精染成藍色，計算細胞凋亡率。

1.5 統計學方法 所有數據均采用均數±標準差（x± s ）表示，利用SPSS 22.0統計軟件，組間比較采用單因素方差分析，組內比較以t檢驗判斷差異顯著性，顯著性差異水平標準為P＜0.05，極顯著性差異水平為P＜0.01。

2 結果

2.1 “調臟通絡”電針對血糖的影響 造模前，各組大鼠血糖值均正常，差異無統計學意義（P＞0.05）。成模時，對照組、電針干預組和藥物干預組大鼠的隨機血糖值均明顯高于正常對照組大鼠及各組造模前隨機血糖值（P＜0.01），且隨著病程時間延長，血糖水平逐漸升高。造模12周后，模型對照組、電針干預組、藥物干預組大鼠血糖均差異無統計學意義（P＞0.05）。各組大鼠血糖測定結果，見表1，圖1。

2.2 “調臟通絡”電針對細胞凋亡的影響 干預12周后，模型對照組坐骨神經有大量TUNEL陽性細胞分布，電針及藥物干預組TUNEL陽性細胞分布介于正常對照組及模型對照組之間；與正常對照組相比，模型對照組、電針干預組及藥物干預組大鼠凋亡細胞比例均顯著升高（P＜0.01），與模型對照組相比，電針干預組及藥物干預組大鼠凋亡細胞比例均顯著降低（P＜0.01），電針干預組及藥物干預組組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2，表2。

表1 各組大鼠血糖測定結果比較（x± s ） mmol/L

圖1 各組大鼠血糖測定結果（mmol/L）

圖2 各組大鼠TUNEL陽性細胞分布比較

表2 各組大鼠坐骨神經凋亡細胞陽性百分比比較（x± s ）

3 討論

電針是指針刺腧穴得氣后，在針上通以微弱電流以治療疾病的一種中醫療法。其具有神經刺激、促進血液循環、鎮痛等綜合調理作用，現普遍應用于神經系統、心腦血管、消化系統疾病的臨床治療[14-17]。現代醫學證明，電針可有效改善病變局部神經傳導速度，促進神經再生，但其影響機制及作用機理還需進一步考量與細化研究。

DPN作為消渴兼癥，中醫早有記載，《續名醫類案》中提到了消渴病人“一日夜小便二十余度，清白而長，味且甜，……腰膝以下軟弱，載身不起”，指出消渴日久，可致肢痿軟弱，重者不能起身。課題組經研究發現，DPN在陰津虧損，燥熱偏盛的基礎病機上，可發展至血瘀絡阻或陰陽俱虛證型。故治療上應以“調臟通絡”為指導原則。同時，電針作用人體產生一定的生物學效應，在針上通以人體生物電的微量電流波，以刺激穴位。因此，課題組首創“調臟通絡”電針法，取肺俞、脾俞、腎俞、足三里、三陰交、合谷、太沖為主穴治療DPN，并收到了良好的臨床療效。本研究結果顯示，DPN大鼠在電針干預及藥物干預12周后，經TUNEL法染色后，坐骨神經細胞凋亡陽性百分比顯著降低，電針干預組及藥物干預組組間差異無統計學意義。說明在DPN疾病進程中，坐骨神經發生細胞凋亡，而電針和藥物干預可以顯著降低細胞凋亡比例而起到保護坐骨神經的作用。

DPN的發病與周圍神經細胞的凋亡關系密切。周圍神經損傷引起的細胞凋亡是多種生理病理因子參與并由凋亡相關基因啟動的細胞程序性死亡過程[18]。周圍神經損傷后，細胞凋亡是參與神經元變性壞死的主要原因[19-20]。因此，從周圍神經細胞凋亡的角度開展DPN的研究工作，可有效提高DPN發病機制與干預效應的研究水平。周圍神經損傷阻斷胞體、軸突、效應器之間的反饋通路，導致神經元失去營養因子而凋亡。因此，筆者猜想“調臟通絡”電針是通過抑制DPN大鼠周圍神經細胞凋亡而對坐骨神經起到一定的保護作用，神經細胞凋亡比例可以反應神經損傷程度。本研究的發現為深入開展DPN的研究工作提供了新的啟示和借鑒。接下來，筆者將進一步探究針灸療法對DPN周圍神經細胞凋亡的保護效應與作用機制。