苓桂術甘湯和真武湯對阿霉素腎病大鼠調節性T細胞的影響

李 曼，李智玲，彭桉平，徐 鵬，田瑞敏，黎 創，毛 煒，何 敏

（廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣州 510370）

原發性腎病綜合征是臨床常見的腎臟疾病，但該病的致病機制尚未明確。新近研究[1]表明，免疫機制介導了該病的發生發展。調節性T細胞（Treg細胞）是一類具有免疫抑制作用的T細胞亞群，調控各種免疫功能，包括抑制細胞因子的表達和分泌、下調黏附分子的表達、誘導細胞免疫功能、抑制炎性反應和過度反應、抑制效應性CD4+和CD8+細胞的功能等[2-3]。轉錄因子Foxp3（Forkhead box p3）是Treg的特征標志之一，是調控CD4+CD25+Treg細胞發育及啟動抑制功能的總開關，可抑制過度免疫反應，減輕對機體的損傷，減輕腎臟炎癥和提高Treg比例有利于恢復腎臟功能[4]。慢性腎病患者多被辨證為脾腎兩虛證[5]，以苓桂術甘湯和真武湯為代表的滲濕利尿藥，具備溫陽利水氣，健脾化飲等功效，能有效消除水腫和蛋白尿癥狀，是針對脾腎兩虛病證的方劑，效果明確[6-7]。然而目前對中藥湯劑的研究主要集中在療效研究，免疫機理尚未明確。本實驗通過構建經典的腎病綜合征模型，即阿霉素腎病大鼠模型[8]，觀察苓桂術甘湯和真武湯對Foxp3表達和Treg細胞比例的影響，旨在用現代醫學的方法探討2個方劑對慢性腎病的免疫調控機制，為其臨床治療提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 6～8周齡Sprague-Dawley（SD）大鼠32只，雄性，健康，無腎功能異常，體質量180～200 g，購于廣州中醫藥大學大學城實驗動物中心，飼養條件：SPF級，亮/暗周期，室溫22～24 ℃，濕度50%～70%，自由進食和飲水（食物及飲水均經消毒處理）。

1.1.2 試劑 鹽酸多柔比星（阿霉素）購自深圳萬樂藥業有限公司，APC anti-rat CD4熒光抗體、PE anti-rat Foxp3熒光抗體、Alexa Fluor 488 anti-rat CD25熒光抗體、固定劑和破膜劑試劑盒購自BD公司；淋巴細胞分離液購于Axis-Shild PoCAS公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司；Taq DNA聚合酶、M-MLV和反轉錄試劑盒均購自Promega公司；引物由上海英駿有限公司合成。

1.1.3 藥物制備 苓桂術甘湯組成（《金匱要略》）：茯苓、桂枝、白術、甘草按4:3:3:2配伍，真武湯組成（《傷寒論》）：茯苓、芍藥（白芍）、白術、生姜、炮附子按9:9:6:9:4配伍。煎煮3次，每次煎煮前加水浸泡30 min，煎煮1 h，2次煎煮液混勻，在80 ℃恒溫浴條件下，濃縮成100 %水煎液，4 ℃冰箱保存備用。采用高效液相色譜技術對中藥飲片及煎劑進行檢測。全部中藥飲片均購自廣東康美藥業有限公司（附質量檢查報告），并送廣東省藥檢所質檢確認合格。

1.2 方法

1.2.1 建模 SPF 級 6～8 周齡健康雄性 SD 大鼠 32只，體質量（ 200±20）g，隨機分為 2 組，空白對照組 8 只與模型組 24 只，其中模型組 3 周成模后分為 3組：病理對照組，苓桂術甘湯組和真武湯組。空白對照組注射等量生理鹽水，其他3組一次性尾靜脈注射阿霉素5 mg/kg。0～3周觀察大鼠的一般情況。

1.2.2 藥物處理 模型建成后，從第4周開始苓桂術甘湯組和真武湯組按19.00 g 生藥/kg體質量每日分別灌胃干預4周，空白對照組及病理組予等量生理鹽水灌胃干預4周。

1.2.3 尿液收集與檢測 用代謝籠收集尿液，分別于3、7周的最后1 d收集各組大鼠24 h尿液標本，測量24 h尿量。吸取尿液，25 ℃、1 000 r/min，離心10 min后，取上清液放入- 20 ℃冰箱保存備用。尿蛋白濃度采用BCA法測定。24 h尿蛋白定量（mg/d）=尿蛋白濃度（mg/L）×24 h尿量（L）。

1.2.4 脾淋巴細胞的制備 用 10%水合氯醛溶液按0.32 mL/100 g 腹腔內注射麻醉大鼠后，打開其腹部，無菌取脾臟，置于200目的濾網上，以注射器針芯研磨，并加入PBS沖洗，制備成細胞懸液，用Ficoll進行密度梯度離心（22 ℃、2 000 r/min，20 min），吸取淋巴細胞層，用紅細胞裂解液去除紅細胞，計數，調整細胞濃度，用于抗體染色和RT-PCR。

1.2.5 流式細胞術檢測脾Treg細胞比例 收集上述細胞，在檢測管內加入APC anti-rat CD4和Alexa Fluor 488 anti-rat CD25熒光抗體，4 ℃避光孵育30 min；固定破膜后，加入PE anti-rat Foxp3熒光抗體染色4 ℃避光孵育30 min，重懸后采用BD Canto II流式細胞儀檢測，FACS Diva 7.0 軟件分析流式檢測結果，用Treg細胞比例占CD+T細胞比例來評價Treg細胞的水平。

41.2.6 總RNA提取 提取細胞總RNA，操作嚴格按照Trizol試劑說明書操作，提取后的RNA于- 20 ℃冰箱中保存。分別通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度儀，檢測所得總RNA的質量和濃度。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統計學處理，計量數據用均數±標準差（x±s）表示，2組數據之間比較用Student’s-t檢驗；相關性分析采用Pearson或Spearman相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況比較 空白對照組實驗全程精神好，食量正常，未出現疾病癥狀。模型組大鼠注射后出現精神萎靡、體毛蓬松糾結、大便稀溏，食量減少、體質量減輕，逐漸出現水腫。在平行給藥后，病理組大鼠精神差，體質量減輕，食欲減退嚴重，少量大鼠出現輕度腹水。真武湯和苓桂術甘湯組大鼠在給藥后精神稍好，食量較病理組大，大便呈顆粒狀，水腫較輕。

2.2 各組大鼠干預前后24 h尿量與尿蛋白變化比較 大鼠經尾靜脈注射阿霉素3周（第3周）后出現蛋白尿，尿蛋白總量顯著高于空白對照組（P＜0.05），表明急性腎衰竭模型制造成功，模型組各組之間24 h尿蛋白無統計學意義（P＞0.05）。藥物干預4周后（第7周），真武湯組及苓桂術甘湯組與病理組相比蛋白尿水平明顯降低，且差異具有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠干預前后24 h尿量與尿蛋白變化比較（x± s ，n = 8）

2.3 各組大鼠脾淋巴細胞中Treg細胞比例比較 流式細胞術檢測結果顯示模型組脾Treg細胞（CD+CD+425）占T細胞比例為（4.29±1.57）%，明顯低于空白對照組（8.32±1.49）%，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與病理組相比，真武湯組Treg細胞比例升高（6.50±1.27）%，且差異具有統計學意義（P＜0.05），而苓桂術甘湯組與病理組相比無統計學意義（P＞0.05），見圖1。

2.4 真武湯及苓桂術甘湯對大鼠脾淋巴細胞中Foxp3 mRNA表達的影響 RT-PCR檢測結果顯示：與空白對照組相比，模型組Foxp3的mRNA表達水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，真武湯組Foxp3的mRNA表達明顯增強，而苓桂術甘湯組表達增加不明顯，見圖2。

3 討論

本實驗構建了阿霉素腎病大鼠模型[9-13]，真武湯和苓桂術甘湯處理的大鼠與腎病大鼠精神狀況、反應敏捷性均有改善，腎病造成的蛋白尿表現也明顯降低。苓桂術甘湯可以顯著降低尿蛋白含量；通過流式細胞儀檢測脾臟CD4+CD25+Foxp3+淋巴細胞（Treg）占脾總淋巴細胞中的比例，苓桂術甘湯對Treg比例未有明顯影響。有研究[14]證實，苓桂術甘湯對環磷酰胺模型大鼠免疫功能的改善作用與其促進Th細胞功能、恢復T細胞亞群的比例、增強IL-2活性有關，而通過IL-2刺激或直接注射Treg細胞則有助于保護模型大鼠腎功能。結合本實驗結果分析，苓桂術甘湯對腎病的作用機制，可能與調節Treg活性有關。真武湯除減少尿蛋白外，檢測到Foxp 3 mRNA表達增加和Treg細胞比例升高，可能是其在慢性腎病中的作用機制之一。真武湯中的白芍對細胞免疫呈雙向調節：低濃度促進，高濃度抑制，對脾B淋巴細胞也呈雙向調節，可能與調節TH/Ts比例有關。芍藥總苷可顯著增加Treg百分比，并且通過下調Foxp3啟動子甲基化水平增加細胞Foxp 3表達，同時提高細胞IFN-γ和IL-2表達水平，芍藥總苷也能通過抑制樹突狀細胞的功能，減輕免疫介導的炎癥反應[15]。

圖1 各組大鼠脾淋巴細胞中Treg細胞比例比較

圖2 各組大鼠脾淋巴細胞中Foxp3 mRNA表達水平

綜上所述，借助阿霉素腎病模型，筆者闡明了真武湯和苓桂術甘湯可改善腎病造成的尿蛋白癥狀，苓桂術甘湯對Treg比例未有明顯改變，真武湯可上調Foxp 3 mRNA表達以及提高Treg細胞比例，提示Treg比例的調節與臟腑心脾無關，與腎相關，溫陽化飲對腎病的治療效果更加顯著。但是，方劑中何種中藥起到主要作用，通過何種途徑實現對Foxp 3與Treg細胞的調節還有待進一步研究。