不同殼聚糖改性黏土對小球藻的絮凝效應及絮凝條件優選

趙雨楓，宋新山※，曹 新，趙志淼，宋 錦，袁世紅，陳 燕

（1. 東華大學環境科學與工程學院，上海 201620；2. 上海海洋大學海洋生態與環境學院，上海 201306）

0 引 言

微藻分布廣泛，其光合效率高、生長速度快，固碳和環境適應能力強，是一種新型的低碳環保資源[1]。小球藻含有豐富的蛋白質、不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid, PUFA）、生物多糖，具有抗腫瘤活性、抑制癌細胞、增強免疫等作用[2]，擁有廣泛的應用前景。但小球藻個體微小（3～30μm），且在培養液中的濃度低（<1 g/L），這導致工業規模的微藻養殖采收難度大、成本高。因此，尋求一種高效率、綠色無污染的絮凝劑是當前亟需解決的問題。

目前，絮凝沉降是微藻采收和微藻去除中最為廣泛的技術之一[3]。常用的絮凝劑主要有金屬鹽類和高分子聚合物，但絮凝過程中金屬離子的引入會對水環境形成二次污染，也對微藻產品的后續深加工造成影響。殼聚糖是一種無毒可生物降解的天然高分子化合物，它具有良好的吸附性能，較好的電中和能力和網捕架橋作用，在水處理[4-6]、食品加工和化學工業中都有廣泛的應用[7-9]。研究表明，藻液的pH值控制在4～6時，殼聚糖可以有效的絮凝微藻[10]。然而微藻培養至中后期時，藻液pH值通常呈現堿性（9～10.5左右）[11]，大幅度改變pH值會使得絮凝成本增加。近年來，殼聚糖復合無機材料已成為研究熱點。在無機材料中，黏土礦物作為一種廉價易得、天然無污染的材料，已逐漸應用于藻類的絮凝，而將殼聚糖和黏土礦物進行復合絮凝采收微藻的研究較為少見。

因此，本研究選擇 3種不同類型的無機礦物膨潤土（鏈狀）、硅藻土（直鏈狀）、沸石（纖維狀），采用酸性殼聚糖改性，以小球藻作為目標微藻，研究絮凝劑的濃度、絮凝的靜置時間、藻液pH值和殼聚糖與不同黏土礦物的比例對藻類絮凝效果的影響，從而確定小球藻絮凝的最佳絮凝劑和最佳條件，為工業化采收微藻提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

藻種：蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa），購于中國科學院野生生物種質-淡水藻種庫，編號FACHB-10。

黏土礦物：Na-膨潤土（內蒙古天宇膨潤土科技有限公司）、硅藻土（青島三星硅藻土有限公司）、人造沸石（國藥集團化學試劑有限公司）、殼聚糖（BR，分子量161.16，脫乙酰度 80.0%～95.0%，國藥集團化學試劑有限公司）。其余試劑均為分析純，購于上海國藥。

1.2 試驗方法

1.2.1 藻的培養

采用BG11培養基（pH值為7.2），培養基的成分包括 NaNO31.5 g/L，KH2PO40.04 g/L，MgSO4×7H2O 0.075 g/L，CaCl2×H2O 0.036 g/L，檸檬酸 0.006 g/L，檸檬酸鐵銨0.006 g/L，乙二胺四乙酸二鈉 0.001 g/L，NaCO30.02 g/L，A5（H3BO32.86 g/L，MnCl2×4H2O 1.86 g/L，ZnSO4×7H2O 0.22 g/L，Na2MoO4×2H2O 0.39 g/L，CuSO4×5H2O 0.08 g/L，CoCl2×6H2O 0.04 g/L）取1mL/L。將配制好的培養基高壓滅菌后備用。藻種懸浮液與培養液以 1∶10的體積比接種，在溫度20～25 ℃，光照強度2 000～3 000 lx，12 h光照/12 h黑暗條件下進行擴大培養（6 d左右），期間每天搖瓶3～4次避免貼壁。

1.2.2 藻細胞數的測定

用血細胞計數器進行細胞計數，并采用紫外分光光度法測定680 nm處的吸光度值OD680，得到小球藻細胞與密度的標準曲線：y=20x-0.309（R2= 0.998），其中y表示藻細胞數量（106個/mL），x表示OD680。

1.2.3 絮凝劑的制備

稱取1.5 g殼聚糖于100 mL的燒杯中，加入50 mL的鹽酸溶液（5 mol/L），室溫攪拌至完全溶解。按照殼聚糖與黏土礦物質量比為 1∶2，1∶6，1∶10，1∶14，分別稱取一定質量的硅藻土、膨潤土和沸石加入燒杯中，常溫攪拌24 h。將溶液抽濾，所得固體于75 ℃干燥，研磨，過200目篩，分別制得殼聚糖改性硅藻土（chitosan modified diatomite，CMD）、殼聚糖改性膨潤土（chitosan modified bentonite，CMB）和殼聚糖改性沸石（chitosan modified zeolite，CMZ）3種復合絮凝劑。同時3種未改性的硅藻土（diatomite，DE）、膨潤土（bentonite, BE）和沸石（zeolite，ZE）絮凝劑研磨，過200目篩，備用。

1.2.4 絮凝效果試驗

以絮凝率表征小球藻的采收情況，設置不同的絮凝劑濃度（0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6 g/L）、藻液pH值（2、4、6、8、9、10）和靜置時間（0、10、30、60、90、120 min），取生長對數中后期的小球藻液置于500 mL燒杯中進行試驗。分別將一定量的 3種復合絮凝劑加入400 mL小球藻液中，調節pH值，同時設置空白對照組（原藻液），快速攪拌后靜置沉降。取液面下3～5 cm處藻液測其吸光度OD680值，通過小球藻細胞數與光密度的標準曲線換算成細胞數，并根據式（1）計算小球藻的絮凝率。

其中N0是原小球藻細胞數量，N是靜置沉降后的小球藻細胞數量。

1.2.5 復合絮凝劑表征

將改性前后的復合絮凝劑樣品干燥保存，采用掃描電子顯微鏡（JSM-5600LV, JEOL）觀察其形態。

1.2.6 數據處理與分析

用Excel進行數據統計和繪圖，結果表示為平均值±標準偏差（SD），所有數據的平均值和標準差都是3次重復的結果。

2 結果與分析

2.1 絮凝劑濃度及靜置時間的影響

絮凝劑濃度和靜置時間是影響絮凝率的重要因素。絮凝前用鹽酸溶液將介質的 pH值調節至 8（偏堿性），當殼聚糖與黏土礦物的配比為1∶6時，在不同的絮凝劑濃度和靜置時間下分別觀察 3種復合絮凝劑對小球藻液絮凝率的影響，如圖1所示。圖1a～圖1c表明，當絮凝劑濃度為0.2 g/L，沉降30 min后，CMD、CMB、CMZ對小球藻的絮凝率分別為90.61%、80.84%和66.14%，并且對于CMD，隨時間變化其絮凝率并不發生顯著改變，對于CMZ，沉降60 min后其絮凝率才基本趨于平穩。當絮凝劑濃度小于0.2 g/L時，CMD的絮凝率要高于另外兩者20%～30%，且到90 min后3種絮凝劑才逐漸達到穩定。當絮凝劑濃度大于0.2 g/L時，隨濃度的增加， 3種復合絮凝劑的絮凝率僅增加2%～6%。這是因為隨著絮凝劑濃度的增加，對小球藻表面所帶的負電荷膠體吸引的容量越大。但當濃度繼續增大時，會使得水體中膠體的Zeta電位持續上升，由負電狀態逐漸變為正電狀態。研究表明一般天然水體中膠體顆粒的 Zeta電位在-30 mV以上，當電位上升到-15 mV左右時可以達到良好的絮凝效果[12]。因此隨著濃度的繼續增大，對小球藻的絮凝率并沒有提升，甚至還可能會導致絮凝率的大幅下降。

圖1 不同濃度和靜置時間下不同絮凝劑對小球藻絮凝率的影響Fig.1 Effects of flocculant concentration and time with different flocculants on flocculation efficiency of C. pyrenoidosa

可見，CMD絮凝劑絮凝率最高，沉降速率最快。這是因為藻細胞的絮凝率與絮凝劑的理化性質密切相關。絮凝劑的比表面積和表面電性是影響絮凝率的主要因素[13-14]。不同絮凝劑的比表面積有著一定的差異。此外，黏土絮凝藻細胞的過程取決于其顆粒與藻細胞的碰撞效率和黏土與藻細胞的黏連作用，不同的黏土具有不同的分形維數[15]。黏土吸附在藻細胞表面時，分形維數較低的絮體與分形維數較高的絮體相比，有較大的接觸面積，從而增加絮體的碰撞頻率，使得沉降速率更快。

目前，改性黏土主要分為無機改性、有機改性和天然化合物改性，其改性后的黏土在水華治理中有著廣泛的應用[16]。研究表明，除了絮凝劑的表面電性外，黏土礦物的結構、種類和硅鋁比亦是影響復合絮凝絮凝效率的另一個重要因素[17]。本研究采用了天然改性劑對 3種黏土礦物（硅藻土、膨潤土和沸石）進行改性，同時通過酸化處理，一方面可以有效的疏通了孔道，同時氫離子置換出黏土礦物中可溶的 Ca2+、Mg2+等陽離子，有利于黏土礦物在水中的分散性[18]。另一方面，黏土顆粒表面形成帶正電的多鋁化合物，使得藻細胞與黏土顆粒表面的電中和作用增強[19]。本研究采用鈉基膨潤土（蒙脫石含量 85%～90%）具有較好的離子交換性能。而絲光沸石，其具有較高的硅鋁比（4.17~5.00），而藻的絮凝效率與黏土的硅鋁比呈現負相關的線性關系[17]，因此表現出的絮凝性能相對較差。與膨潤土與沸石相比，硅藻土具有特殊的多孔構造，更有利于微藻的吸附，因此絮凝效果最佳。

2.2 pH值的影響

pH值對含藻水體表面電荷Zeta電位有較大影響，會導致絮凝效果不同[20]。圖2為當絮凝劑濃度為0.2 g/L，不同pH值條件下3種復合絮凝劑對小球藻絮凝率的影響。

結果表明，當pH值為8時，3種絮凝劑中CMD的絮凝率最高，為94.4%，且絮凝率隨時間不發生明顯變化，當pH值為9時，CMD的絮凝率為91.2%，與pH值為8時相比其絮凝率變化不大。而當pH值為酸性（4、6）和堿性（11）時，其CMD絮凝率分別下降了約28%和11%。可見，pH值過低和過高時都不足以發生有效的絮凝，且小球藻的絮凝率隨沉降時間的延長，會發生明顯的變化。當pH值增大時，改性后殼聚糖與黏土礦物之間雖然有相互作用，但是黏土礦物表面的Zeta電位為負值，帶有大量的負電荷，而在堿性介質中溶解的殼聚糖不足以中和小球藻細胞表面的電荷，因此只有部分藻類絮凝[21]。當pH值較小時，殼聚糖溶解性較好，絮凝劑中主要是黏土礦物發揮作用，但黏土礦物絮凝能力較差，因此對小球藻的絮凝率低。研究表明，殼聚糖在酸性水溶液中（pH值為 5）對藻類的絮凝率可高達 95%，其絮凝效果優于QCMC，PAM，Al2(SO4)3和FeCl3等常規絮凝劑，但在中性和堿性溶液中絮凝率顯著下降[22]。這主要與殼聚糖的溶解性相關。研究表明采用殼聚糖改性海泡石的絮凝劑治理景觀水，當濃度為18 mg/L，pH值為8的條件下，對濁度的去除率最高[23]。這與本研究的結果一致。

此外，3種改性絮凝劑中，CMD絮凝劑的絮凝率最高，且在弱堿性條件，靜置30 min后，其小球藻的絮凝率隨pH值變化僅改變10%～13%，這表明CMD是較為穩定的絮凝劑，適用的pH值范圍更廣。因此CMD絮凝劑在一定程度上擴大了絮凝劑使用的pH值范圍，可以有效的節約成本。

圖2 不同pH值下不同絮凝劑對小球藻絮凝率的影響Fig.2 Effects of pH value with different flocculants on flocculation efficiency of C. pyrenoidosa

2.3 殼聚糖與黏土礦物配比的影響

當總質量相同時，殼聚糖與黏土礦物不同的配比對絮凝率也有著一定的影響。如圖3可見，調節藻液pH值為8，絮凝劑的濃度為0.2 g/L，靜置30 min后，隨著殼聚糖與硅藻土配比增大，絮凝率呈現先增大后減小的趨勢。其中CMD絮凝劑對小球藻的絮凝率明顯高于其他兩者。在殼聚糖與硅藻土配比為 1∶6時，絮凝率最佳為92.8%，而當配比增大到1∶14時，絮凝率相比最佳配比下反而下降了 10%。這是因為過多的硅藻土不能與殼聚糖進行復配，部分析出懸浮在藻液中，導致絮凝率降低。

2.4 絮凝劑改性前后對絮凝效果影響的比較

上述試驗結果表明，當 pH值為 8，絮凝劑濃度為0.2 g/L時，靜置120 min后，3種改性后的絮凝劑（CMD、CMB、CMZ）對小球藻的絮凝率分別可以達到96.61%、92.36%、88.59%。在相同的試驗條件下，對3種未改性的絮凝劑硅藻土（diatomite，DE）、膨潤土（bentonite，BE）、沸石（zeolite，ZE）和殼聚糖對小球藻的絮凝率進行試驗，以確定復合材料的使用價值及意義。在不同濃度下，DE、BE、ZE和殼聚糖對小球藻絮凝率隨置時間的變化如圖4所示。

圖3 殼聚糖與黏土礦物的配比對小球藻絮凝率的影響Fig.3 Effects of different mass ratios between chitosan and clay minerals on flocculation efficiency of cells of C. pyrenoidosa

結果表明，未改性的DE、BE和ZE絮凝劑與改性后的的絮凝劑相比，其絮凝效率僅為 CMD、CMB、CMZ處理后的45%～50%。單獨使用DE、BE和ZE絮凝小球藻，當濃度低于0.6 g/L（靜置120 min），其小球藻的絮凝效率均低于 45%。杜勝藍等[24]采用沸石除藻，發現沸石濃度小于 500 mg/L時, 銅綠微囊藻去除效率均低于40%。這表明未改性的黏土礦物對藻細胞無明顯的絮凝效應。這是由于黏土礦物與藻細胞的絮凝過程主要是由于兩者之間的撞形會逐漸形成絮體，絮體不斷增大累積，但是黏土礦物顆粒表面通常帶有負電荷，與帶負電的藻細胞產生經典排斥會導致兩者的碰撞效率降低，影響絮凝效率，同時黏土礦物溶膠性差，容易迅速凝聚。

假設正弦電流源為iP(t)=IPsin(ωt),其中IP是電流幅值,ω是振動角頻率。整流橋上的4個二極管的壓降均為VD,則傳統全橋整流電路輸出電流的平均值是

圖4a～4c表明，在相同靜置時間下，隨著3種未改性的絮凝劑濃度的增加，小球藻的絮凝效率僅增加5%～10%。這是由于黏土礦物的使用量較小，并沒有有效的絮凝。亦有研究表明使用海泡石處理去除水體中的銅綠微囊藻時，濃度為2.25 g/L，可去除85%以上的藻細胞[25]。沸石對水體銅綠微囊藻的去除率隨著濃度的增加而增大，當濃度為25 g/L時，其去除率可達93%[26]。因此黏土礦物的使用量過大也成為了限制黏土礦物使用的一個重要因素。與改性前的DE相比，改性后僅在0.2 g CMD中加入 0.028 g的殼聚糖，其小球藻的絮凝率提高了60.03%。這表明通過殼聚糖改性黏土礦物，提高小球藻的絮凝效率的同時，也有效減少了黏土礦物的用量。圖4d表明單獨使用殼聚糖對小球藻絮凝效率的影響。結果表明，靜置30 min后，小球藻的絮凝效率僅為7.41%～12.41%，靜置120 min后，其絮凝率可達32.41%～47.09%。而且濃度大于0.4 g/L時，絮凝效率才有一定的提高。這表明殼聚糖用量較小時，對微藻的絮凝效率并不高。這是因為在pH值為8微堿性的溶液中，殼聚糖的溶解能力下降，導致絮凝能力較差。研究表明，殼聚糖在酸性溶液中絮凝能力較強，而當溶液pH值大于7，絮凝能力迅速下降[27]。

因此藻液較高的 pH值是限制殼聚糖絮凝效率的重要因素。與改性前相比，殼聚糖改性黏土礦物后，在相同的絮凝條件下（pH值為8），改性后0.2 g的CMD中僅含有 0.028 g的殼聚糖，與單獨使用殼聚糖（濃度為0.05 g/L），其小球藻的絮凝效率提高了64.2%。

圖4 絮凝劑硅藻土（DE）、膨潤土（BE）、沸石（ZE）和殼聚糖對小球藻絮凝率的影響Fig.4 Effects of DE、BE、ZE and chitosan flocculants on flocculation efficiency of C. pyrenoidosa

對比 3種黏土礦物改性前后對小球藻絮凝效果，不難發現改性后復合絮凝劑有效的改善了殼聚糖和黏土礦物的理化性質，靜置30 min后，CMD絮凝劑對小球藻的絮凝率比 CMB絮凝劑高出 10%，比 CMZ絮凝劑高出20%。同時可以減少單獨使用兩者的用量，使得藻細胞的絮凝效率得到了明顯的提高。一方面因為用殼聚糖對黏土進行包覆改性時，殼聚糖會改變黏土顆粒表面特性和表面電性。使得原本表面帶有正電荷的黏土顆粒帶正電荷。這主要是因為改性過程的酸化處理，殼聚糖溶于酸后，殼聚糖上質子化的胺數量會有所增加，使得其分子鏈上帶有大量的正電荷，表現出陽離子絮凝劑的特性[28]。已有研究表明帶電基團數量的增加會提高顆粒的不穩定性，易發生沉淀過程[29]。相比未改性的黏土礦物和殼聚糖，改性后使得絮凝劑與帶負電荷的藻細胞之間排斥力減小，電中和效應得到了加強。因此藻細胞更容易脫穩，使得微藻的絮凝率大幅度提高。另一方面，殼聚糖對黏土進行包覆改性時，會增強絮凝劑與藻細胞之間的架橋網捕作用。這是因為殼聚糖具有較大的分子量，其分子鏈較長，在溶液中呈現較大的黏度[30]。殼聚糖的高分子鏈附著在黏土礦物的表面或周圍，對于溶液中懸浮的微藻細胞有很好的網捕架橋作用，使得藻細胞絮凝而發生沉降。同時殼聚糖與黏土礦物之間的吸附交聯作用使絮凝劑形成一定的結構空間，增大比表面積，增強了藻細胞與絮凝劑之間的接觸，使得有效碰撞增強，為小球藻的附著提供了更大的空間。此外，單獨使用黏土礦物絮凝后，絮體結構不穩，容易重新分散到水體中[13]。而改性后，絮凝劑的密度和體積大于改性前的黏土礦物，有效地增加了絮體的質量，使得聚集起來的絮體更加緊密。改性后的絮凝劑可以改善黏土礦物溶脹性，加快藻液中固液分離速度，使得絮體的沉降速度更快，更有利收集。同時緊密的絮體結構也可以有效的避免藻細胞重新進入水體。

2.5 改性前后絮凝材料的表征

圖 5為硅藻土、殼聚糖改性硅藻土的掃描電鏡圖（SEM）。本研究采用的硅藻土是由筒狀的直鏈藻藻殼組成，表面具有很多微孔，同時還具有一個中心內孔，其空心管狀結構使得硅藻土表現出較好的架橋網捕作用，有利于硅藻土與藻細胞之間絮凝。圖5表明經過改性后，其硅藻土的空心管狀結構并沒有發生破壞。而改性前篩管硅藻土（圖 5a）表面光滑，在其表面整齊的排列著許多微孔，僅有小部分孔徑被堵塞。改性后硅藻土（圖5b）表面較為疏松，凹凸不平，說明殼聚糖附著在硅藻土的表面，增大了絮凝劑的比表面積，更有利于對小球藻的吸附。

圖5 硅藻土和CMD絮凝劑的掃描電鏡圖Fig.5 SEM of diatomite and CMD flocculant

2.6 絮凝劑的綜合比較

根據試驗結果，確定最佳復合絮凝。對改性前后的殼聚糖、DE和CMD在最佳絮凝條件下的絮凝效率、經濟成本以及使用過程中的優缺點進行總結比較，如表 1所示。

表1 不同絮凝劑的比較Table 1 Comparison of different flocculant

3 結 論

通過采用酸性殼聚糖對3種不同類型的黏土礦物（膨潤土、硅藻土、沸石）進行改性，制備無公害復合絮凝劑，并分別對改性前后絮凝劑絮凝效率和絮凝條件（復合絮凝劑的濃度、靜置時間、藻液pH值和殼聚糖與黏土礦物的比例）的研究得到如下結論：

1）殼聚糖改性硅藻土（CMD）絮凝小球藻的最佳條件是：調節pH值為8，殼聚糖和硅藻土的配比為1：6，濃度為0.2 g/L，沉降120 min。在最佳條件下，對小球藻的絮凝率可達到約96.16%。

2）殼聚糖分別改性硅藻土、膨潤土與沸石得到的 3種復合絮凝劑（CMD、CMB、CMZ）的絮凝效果均明顯高于殼聚糖和3種未改性的黏土礦物（DE、BE、ZE）。比較 3種復合絮凝劑，殼聚糖改性硅藻土對小球藻的絮凝效果最佳。在最適絮凝條件下，靜置30 min后，CMD絮凝劑對小球藻的絮凝率比 CMB絮凝劑高出 10%，比CMZ絮凝劑高出20%。

3）改性前后硅藻土表面形貌表征表明，經過殼聚糖改性后的硅藻土表面形態發生了改變，在硅藻土的表面附著了大量的殼聚糖，形成了凹凸不平的表面，一方面更有利于藻細胞的附著，另一方面黏土礦物也有效的增加了絮體的重量，使得聚集起來的絮體更加緊密、沉降速度更快，更有利收集。

4）綜合比較不同絮凝劑（殼聚糖、DE和CMD）絮凝效率、經濟成本以及使用過程中的優缺點可知，CMD是一種高效經濟且環保的微藻絮凝劑，具有良好的應用前景。

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