噬菌體復配抑菌劑對三文魚中沙門氏菌的抑制與保鮮作用

江艷華，許東勤,2，姚 琳，李風鈴，朱文嘉，郭瑩瑩，張 媛，王聯珠※

（1. 中國水產科學研究院黃海水產研究所, 農業農村部水產品質量安全檢測與評價重點實驗室，青島 266071；2. 上海海洋大學食品學院，上海 201306；3. 獐子島集團股份有限公司，大連 116001）

0 引 言

水產品因其味道鮮美和高營養價值深受廣大消費者的青睞，然而，由于特殊的生長環境以及加工過程中與其他物品的接觸，水產品不可避免地存在微生物的污染。水產品具有高水分、高蛋白等營養特點，如果儲存不當，其中的微生物往往會滋生，從而導致產品腐敗，縮短貨架期，如果污染了食源性致病菌，會對人類健康造成嚴重危害，對國家造成巨大的經濟損失。尤其像三文魚等主要以生食為主的海產品，更是高風險的食品[1]。因此，水產品的安全控制與防腐保鮮尤為重要。

目前，水產品中常用的抑菌劑包括茶多酚、殼聚糖、ε-聚賴氨酸、乳酸鏈球菌素（nisin）、雙乙酸鈉、山梨酸鉀等[2]，這些抑菌劑抑菌機理各不相同，單獨使用并不能達到最佳效果，尤其在控制某種致病菌方面靶向性差。噬菌體（bacteriophage或phage）的發現及其在食品中的應用，豐富了抑菌劑的種類，更為食品安全提供了一種安全、高效和靶向性強的生物抑菌劑[3]。噬菌體是細菌的病毒，在自然界中含量豐富，其中裂解性噬菌體在繁殖過程中能裂解并殺死宿主菌。2006年美國食品藥品管理局批準了一種噬菌體混合物作為食品添加劑用于李斯特氏菌的控制[4]，此后，噬菌體在食品安全領域的應用報道越來越多[5-12]。然而，噬菌體的宿主特異性限制了其應用范圍，有研究報道表明，噬菌體與其他抑菌劑復配比二者單一使用能更有效地控制病原菌，同時還可抑制其他腐敗菌的生長，達到對食品防腐保鮮的作用[13-15]。

沙門氏菌（Salmonella）是重要的食源性致病菌之一，能引起人類急性腸胃炎，出現腹瀉、腹痛、發燒和嘔吐等癥狀，其中引起食物中毒的主要為鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌[16]。沙門氏菌在環境中廣泛存在，畜禽肉、蛋、水產品等都可能攜帶該菌，因此，沙門氏菌是多數食品必檢項目，并被規定不得檢出。在中國，由沙門氏菌引起的微生物中毒事件位居第二，但導致的發病人數最多[17]。本研究以沙門氏菌作為靶致病菌，通過篩選能與噬菌體SLMP1復配的抑菌劑，并將復配抑菌劑應用于生三文魚中，評價其對沙門氏菌和腐敗的控制效果，以期為水產品的質量安全控制提供新的技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

沙門氏菌為鼠傷寒沙門氏菌（SalmonellaTyphimurium），購自美國典型微生物保藏中心，編號為 ATCC14028。

噬菌體SLMP1由本實驗室從貝類樣品中分離得到，能裂解鼠傷寒沙門氏菌和部分腸炎沙門氏菌，前期對其生物學特性進行了分析[18]。

1.1.2 樣品

生三文魚購自青島當地超市，試驗前測定樣品中沙門氏菌的污染情況，無沙門氏菌檢出方可用于試驗。在低溫條件下無菌操作將樣品切成約3 cm×5 cm的片狀（約10 g），備用。

1.1.3 培養基及試劑

營養肉湯、營養瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽酸鈉（xylose lysine deoxycholate，XLD）瓊脂、磷酸鹽緩沖液，北京陸橋生物技術有限公司；營養瓊脂半固體培養基，為營養肉湯中添加 0.75%瓊脂配制而成；殼聚糖（脫乙酰度80.0%~95.0%）國藥集團化學試劑有限公司；ε-聚賴氨酸（純度≥95%），浙江銀象生物技術有限公司；乳酸鏈球菌素（nisin，活力>1 000 IU/g），浙江銀象生物技術有限公司；茶多酚（多酚含量≥98%），天津希恩思生化科技有限公司；雙乙酸鈉、山梨酸鉀（純度99%），阿拉丁生化科技股份有限公司；EDTA（乙二胺四乙酸二鈉），純度>99%，索萊寶科技有限公司；三氯乙酸、硼酸 國藥集團化學試劑北京有限公司；SM緩沖液（5.8 g NaCl，2 g MgSO4·7H2O，50 mL 1 mol/L pH 值 7.5 Tris-HCl，5 mL 2%明膠溶液）。

1.2 儀器與設備

SpectraMax i3x酶標儀，美國Molecular Devices公司；麥氏濁度儀，法國生物梅里埃公司；分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌器，日本SANYO公司；恒溫培養振蕩箱，上海智城分析儀器制造有限公司；生化培養箱，日本SANYO公司；生物安全柜，美國NUAIRE公司。

1.3 方法

1.3.1 不同抑菌劑對沙門氏菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）測定

將沙門氏菌培養至麥氏濃度約 1.0，即約 2×108cfu/mL，然后稀釋至2×104cfu/mL。抑菌劑的選擇與配制參考GB 2760-2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》[2]，最高測定濃度比標準規定限量適當升高，即殼聚糖 6.0 mg/mL、茶多酚 1.2 mg/mL、ε-聚賴氨酸1.0 mg/mL、nisin 2.0 mg/mL、EDTA 4.0 mg/mL、nisin+EDTA 0.5 mg/mL+4.0 mg/mL、山梨酸鉀4.0 mg/mL、雙乙酸鈉4.0 mg/mL，其中EDTA作為細胞膜通透劑與nisin復配使用。將抑菌劑進行倍比稀釋，共稀釋 10次，取100μL濃度為2×104cfu/mL沙門氏菌與對應的各稀釋度的抑菌劑100μL混勻，36 ℃培養24 h，采用酶標儀測定菌液在600 nm處的吸光值，以沙門氏菌不生長的最低濃度為抑菌劑的MIC值。

1.3.2 不同抑菌劑對噬菌體SLMP1穩定性的影響

配制最高試驗濃度的抑菌劑溶液，分別與噬菌體SLMP1（終濃度為1×108pfu/mL）混合，置于36 ℃培養48 h，測定噬菌體效價。對照采用無菌水替代抑菌劑溶液。噬菌體效價的測定采用雙層平板法，即對噬菌體懸液進行10倍梯度稀釋，取100μL適當濃度懸液與200μL培養至對數期的沙門氏菌懸液混合，然后加入5 mL溶解后在50 ℃下保溫的營養瓊脂半固體培養基，充分混勻后倒入營養瓊脂平板，待培養基凝固、表面水分晾干后在36 ℃下培養18~24 h，計數平板上噬菌斑數，從而計算噬菌體效價[19]。

1.3.3 噬菌體與其它抑菌劑復配在生三文魚中的應用

1）樣品處理：參照薩姆布魯克《分子克隆實驗指南（第三版）》[20]的方法制備高濃度噬菌體懸液（約 1011pfu/mL），然后稀釋成適宜的使用濃度。每片生三文魚表面接種100μL 1×106cfu/mL的沙門氏菌懸液，放置10 min讓其充分吸收。取250μL抑菌劑（單用和復配，見表1）添加至人工污染了沙門氏菌的三文魚片表面。將處理好的樣品置于無菌封口袋中，于（4±1）℃下貯藏，分別在貯藏3、7、10和14 d時取樣進行菌落總數、沙門氏菌、噬菌體效價以及揮發性鹽基氮（TVB-N）的測定。每個試驗組設3個平行，并重復2次。

表1 噬菌體與抑菌劑復配應用表Table 1 Application of bacteriophage and other bacteriostatic agents

2）沙門氏菌的計數：將10 g樣品加入90 mL磷酸鹽緩沖液中，均質，制成1∶10樣品勻液。為了避免噬菌體對沙門氏菌的干擾，取10 mL樣品勻液，8 000 r/min離心10 min，沉淀重懸于10 mL磷酸鹽緩沖液中，取100μL涂布XLD瓊脂平板；對于菌濃度極低的樣品，將10 mL勻液沉淀重懸于1 mL磷酸鹽緩沖液中，涂布3塊平板（檢出限為1 cfu/g）。在36 ℃培養18~24 h，計數平板上典型沙門氏菌菌落數，從而計算樣品中沙門氏菌含量[21]。

3）菌落總數的測定：按2)方法制成1∶10樣品勻液，取10 mL勻液，8 000 r/min離心10 min，沉淀重懸于10 mL磷酸鹽緩沖液中，進行10倍梯度稀釋，取100μL適當濃度稀釋液涂布營養瓊脂平板；對于菌落總數較低的樣品，則將沉淀重懸于1 mL磷酸鹽緩沖液中，取100μL涂布營養瓊脂平板。將平板置于30 ℃培養72 h，計數平板上菌落數，從而計算樣品中的菌落總數。

4）TVB-N值的測定：TVB-N值的測定參照 GB 5009.208-2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》[22]。即?。?0± 0.001）g均質樣品，加入50.0 mL三氯乙酸溶液振搖1 min，靜置15 min待蛋白沉淀后過濾，采用凱氏定氮儀進行蒸餾，10 mL硼酸加5滴指示劑用于接收蒸餾液，最后以鹽酸標準滴定溶液（0.010 mol/L）滴定至終點。

5）噬菌體效價的測定：將2）中1∶10樣品勻液離心后的上清液用于噬菌體效價的測定，方法參照1.3.2。

1.3.4 數據分析

試驗結果以平均值±標準偏差表示。采用 T檢驗對數據的差異性進行統計分析，P<0.05表示差異性顯著。

2 結果與分析

2.1 不同抑菌劑的MIC值

本研究以沙門氏菌作為靶細菌，分析各種抑菌劑對其抑制效果，表 2為不同抑菌劑對沙門氏菌的最小抑菌濃度。

表2 不同抑菌劑對沙門氏菌的最小抑菌濃度Table 2 Minimal inhibitory concentration of different bacteriostatic agents against Salmonella

在所測試的濃度范圍為，殼聚糖、ε-聚賴氨酸、EDTA、nisin+EDTA對沙門氏菌有抑制作用，而茶多酚和 nisin對沙門氏菌沒有抑制作用。殼聚糖 MIC值為1.5 mg/mL，ε-聚賴氨酸為 0.5 mg/mL，EDTA 為4.0 mg/mL，nisin+EDTA為0.5 mg/mL+4.0 mg/mL，山梨酸鉀為4.0 mg/mL，雙乙酸鈉為2.0 mg/mL。其中ε-聚賴氨酸和山梨酸鉀的MIC超過了GB 2760《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中的允許使用限值（0.25和1.0 mg/g）[2]。雖然有研究證明當茶多酚濃度為8 mg/mL時三文魚片有明顯保鮮作用[23]，但這已經超過國家標準規定的允許使用限值0.3 mg/g[2]。ε-聚賴氨酸抑菌譜廣，對大部分革蘭氏陰性菌和陽性菌、酵母菌和霉菌均具有較高的抑菌活性，是一種安全性高的生物抑菌劑，對海產品有較好的保鮮作用[24]。nisin通常能抑制大部分革蘭氏陽性菌及其芽孢的生長，而對革蘭氏陰性菌抑菌范圍較窄[25]。本研究發現即使在細胞膜通透劑EDTA的作用下，也沒有增加nisin對沙門氏菌的抑菌效果，據報道鼠傷寒沙門氏菌可以改變其脂糖層的組成和結構來減輕對它們的敏感性[26]。山梨酸鉀和雙乙酸鈉能有效抑制霉菌和好養性細菌，在食品防腐保鮮中有廣泛應用[27-28]，然而山梨酸鉀的抑菌效果不明顯，而雙乙酸鈉的抑菌效果則較強。

2.2 噬菌體的穩定性

表 3為不同抑菌劑對噬菌體穩定性的影響作用。nisin、茶多酚、山梨酸鉀和雙乙酸鈉對噬菌體沒有顯著影響。殼聚糖、ε-聚賴氨酸、EDTA能顯著（P<0.05）降低噬菌體的效價，與對照組相比，噬菌體效價分別減少了3.9、1.5、4.0 lg pfu/mL，表明這些抑菌劑對噬菌體有較強的抑制作用。曾有報道 ε-聚賴氨酸對噬菌體有抑制作用，能使大腸埃希氏菌噬菌體失活, ε-聚賴氨酸對病毒的抑制作用最主要是由于聚賴氨酸中的賴氨酸單體數，賴氨酸單體數越高，抑菌活性越強[29]。此外，殼聚糖及其衍生物對噬菌體也有抑制作用，抑制作用與殼聚糖的氨基酸組成有關[30]。而其他抑菌劑對噬菌體的影響作用沒有相關報道。

表3 不同抑菌劑對噬菌體穩定性的影響Table 3 Effect of bacteriostatic agents on stability of phage

2.3 噬菌體與其他抑菌劑復配在生三文魚中的應用

2.3.1 抑菌劑的復配

在測定的抑菌劑中，殼聚糖、ε-聚賴氨酸能夠抑制沙門氏菌的生長，同時在短期內對噬菌體有明顯抑制作用，因此不能與噬菌體進行復配。山梨酸鉀的MIC值超過了國家標準限量的規定[2]，因而不做考慮。雙乙酸鈉MIC值在國家標準規定限值內、同時對噬菌體沒有明顯抑制作用，因此選擇雙乙酸鈉作為與噬菌體復配的抑菌劑。此外，考慮到nisin能抑制革蘭氏陽性菌，是一種安全高效、應用廣泛的生物保鮮劑，以往的研究也發現其對水產品有一定保鮮作用[31]，且對噬菌體沒有抑制作用，因此選擇nisin作為其中一種抑菌劑進行復配。噬菌體濃度參考前期的試驗選擇1×108pfu/g，雙乙酸鈉濃度選擇對沙門氏菌的MIC值，由于抑菌劑以樣品終濃度計（以往的報道多以浸泡液的濃度計），高濃度的nisin溶液很難配制，同時考慮到nisin的成本，本試驗選擇濃度為0.1 mg/g。

2.3.2 不同抑菌劑對沙門氏菌的抑制作用

圖1為不同抑菌劑對沙門氏菌的抑制作用。用噬菌體處理的三文魚片試驗組（P，PN，PSD，PNSD）中沙門氏菌數量顯著降低，其中P和PN組在3 d時降至1.0 lg cfu/g以下，隨后漸趨于0.5 lg cfu/g，但不能完全消除沙門氏菌；而PSD和PNSD組在10 d后才降至1.0 lg cfu/g以下，PNSD組在14 d后低于檢測限（1 cfu/g）。沒有用噬菌體處理的N、SD和NSD組與對照KBS組數量接近，表明在樣品中，nisin和雙乙酸鈉對沙門氏菌沒有明顯抑制作用，這與 Wan等[32]的報道結果一致，即 nisin（500 IU/mL）、EDTA（0.02 mol/L）、山梨酸鉀（3%）復配劑在4 ℃下處理蝦7 d后不能顯著降低沙門氏菌數量。以往的研究表明噬菌體對海產品中沙門氏菌具有較強的控制作用，Galarce等[33]將沙門氏菌噬菌體分別用于生的和熏制的三文魚片中，4和18 ℃時，生三文魚片中腸炎沙門氏菌分別減少了2.82和3.19 lg cfu/g，熏制三文魚中腸炎沙門氏菌分別減少了1.16和1.96 lg cfu/g。本研究的噬菌體對沙門氏菌的抑制作用比上述報道的更強。本試驗使用的雙乙酸鈉在肉湯體系中能抑制沙門氏菌，而在樣品中卻沒有明顯抑制作用，推測可能是樣品基質影響了雙乙酸鈉的抑菌活性。因此，雖然噬菌體裂解譜較窄，但其抑制靶細菌的效果是其他抑菌劑不能比擬的。

2.3.3 不同抑菌劑對菌落總數的影響

圖 2為不同抑菌劑對菌落總數的影響作用。未用其他抑菌劑處理的樣品（KB、KBS、P），菌落總數先增長后穩定在約6 lg cfu/g。只用噬菌體處理的樣品菌落總數與對照組（KBS）相比，沒有顯著性降低，表明噬菌體不能抑制沙門氏菌外的其他細菌。而用其他抑菌劑處理的樣品（N、SD、NSD、PN、PSD、PNSD）與KB、KBS、P組相比，都出現了不同程度的降低，其中SD和PSD組3 d后基本穩定在5.0~5.5 lg cfu/g；N和PN組3 d后穩定在4.5~5.0 lg cfu/g，與初始菌數基本一致。表明nisin和雙乙酸鈉能抑制樣品中的其它細菌，與nisin復配的抑菌效果比與雙乙酸鈉復配的抑菌效果明顯。海產品由于生存在水生環境，其中的菌群為海洋細菌，常見的特定腐敗菌為假單胞菌、腐敗希瓦氏菌、弧菌、嗜冷桿菌等[34]，可能 nisin對其中的優勢菌抑菌效果優于雙乙酸鈉。而NSD和PNSD組的數值則逐漸降低，14 d時PNSD組比只污染沙門氏菌的對照組（KBS）降低了2.5 lg cfu/g，抑菌效果最好。

圖1 不同抑菌劑對沙門氏菌的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of different bacteriostatic agents on Salmonella

圖2 不同抑菌劑對菌落總數的影響Fig.2 Effect of different bacteriostatic agents on total viable counts

2.3.4 不同抑菌劑對TVB-N值的影響

圖3為不同抑菌劑對TVB-N值的影響作用。在低溫儲藏過程中，所有試驗組的TVB-N值均逐漸升高，表明樣品鮮度在緩慢下降，10 d內所有試驗組TVB-N值均低于30 mg/100 g，14 d后KB、KBS、P和PN組的TVB-N值高于30 mg/100g。含有雙乙酸鈉的試驗組SD、PSD、NSD、PNSD的TVB-N含量增長速度較慢，與對照組KBS相比，14 d時TVB-N質量分數分別減少了9.00、8.11、9.98、13.73 mg/100 g，其中PNSD組抑制TVB-N含量增長的效果最好。用雙乙酸鈉處理的 NSD、PNSD組的TVB-N含量變化趨勢與菌落總數變化趨勢一致，SD和PSD組的TVB-N含量比N組和PN組稍好，這與對菌落總數的抑制效果相反。雖然nisin對三文魚中的總細菌有較強抑制作用，但可能雙乙酸鈉對特定腐敗菌的抑制作用比nisin更好，從而使樣品的 TVB-N含量更低。《GB 2733-2015 食品安全國家標準 鮮、凍動物性水產品》中規定了海水魚的 TVB-N含量應小于或等于 30 mg/100g[35]。14 d后含有雙乙酸鈉的試驗組的TVB-N含量仍低于腐敗限值30 mg/100 g，其中噬菌體、nisin和雙乙酸鈉復配處理的樣品TVB-N值最低。

圖3 不同抑菌劑對TVB-N質量分數的影響Fig.3 Effect of different bacteriostatic agents on TVB-N mass fraction of samples

2.3.5 噬菌體在樣品中的穩定性

圖4為不同抑菌劑對噬菌體的影響作用。P和PN組噬菌體效價穩定，而PSD和PNSD組隨著時間延長逐漸降低，14 d時與初始效價相比分別降低了 1.38、1.40 lg pfu/g。從中可以看出，雙乙酸鈉對噬菌體有抑制作用，時間小于3 d時抑制作用不顯著（P> 0.05），隨著處理時間的延長，抑制作用明顯。雖然雙乙酸鈉在長時間作用時對噬菌體有一定抑制作用，但隨著時間的增加，噬菌體、nisin和雙乙酸鈉復配組對沙門氏菌的抑制作用比其他組效果更好，同時保鮮作用最明顯，因此雙乙酸鈉對噬菌體的抑制作用可以忽略。

圖4 不同抑菌劑對噬菌體的影響Fig.4 Effect of different bacteriostatic agents on phage

3 討 論

以往的研究表明，噬菌體對致病菌的抑菌作用效果是明顯的。然而，由于噬菌體是一種微生物，其安全性會引起人們的擔憂。噬菌體分布極廣，凡是有細菌的場所，就可能有相應噬菌體的存在。據估計，噬菌體的豐度是原核生物的 5~10倍左右，是自然界最豐富的生物體[36]。噬菌體是環境中的正常菌群，日常人們食用的生食或熟食品都能分離到噬菌體，不會對人體造成危害。東歐國家就一直研究和生產用于治療疾病的噬菌體制劑，并沒有關于噬菌體不良副作用的報道。此外，動物和人體試驗均證明，噬菌體對動物和人體是安全的[37?39]。因此，噬菌體的安全性較高，可以作用食品添加劑使用。

目前，關于噬菌體與其他抑菌劑的復配研究報道很少，由于噬菌體是一種微生物，與其他抑菌劑復配后能否穩定存在、抑菌效果如何并不清楚，需要開展相關研究。研究結果發現，對沙門氏菌抑制效果較強的抑菌劑對噬菌體SLMP1有不同程度的抑制作用。由于噬菌體的特異性極強，因此只對沙門氏菌有抑制作用，發揮著靶向抑制食源性致病菌的目的，而nisin和雙乙酸鈉則對樣品中其他細菌有抑制作用，發揮著防腐保鮮作用。噬菌體與 nisin、雙乙酸鈉復配后，對生三文魚片中的沙門氏菌、菌落總數和TVB-N值均具有較強的抑制作用，保鮮效果優于各抑菌劑單獨使用或兩兩復配。下一步可以通過分析樣品中菌群結構的變化探討復配抑菌劑的作用機理。

本實驗室前期預試驗驗證了噬菌體SLMP1對生三文魚中不同濃度沙門氏菌的作用，發現當噬菌體效價在 1×108pfu/mL，樣品中102cfu/g的沙門氏菌能迅速降至檢測限1 cfu/g以下。雖然本研究中樣品中沙門氏菌在短期內無法將至檢測限以下，但自然污染的樣本中沙門氏菌的濃度一般要低于本試驗設置的濃度，因此在實際應用中，噬菌體、nisin和雙乙酸鈉復配抑菌劑的作用效果將會更明顯。本研究將為水產品的質量安全控制提供新的技術手段，下一步將通過開展不同致病菌的噬菌體與其他生物抑菌劑的復配作用研究，篩選更優的復配劑應用于水產品質量安全控制中。

4 結 論

本研究篩選獲得能與沙門氏菌噬菌體SLMP1進行復配的抑菌劑nisin和雙乙酸鈉，將三者復配的抑菌劑應用于污染了沙門氏菌的生三文魚片中，在低溫貯藏條件下，復配抑菌劑與三者單獨使用相比具有明顯的抑菌優勢：1）復配抑菌劑能顯著降低樣品中沙門氏菌的數量，14 d后沙門氏菌低于檢測限1 CFU/g，其中噬菌體發揮著靶向抑制沙門氏菌的作用；2）復配抑菌劑能顯著抑制樣品中菌落總數的增長，14 d后與空白對照相比菌落總數減少了2.5 lg CFU/g，其中nisin對其他細菌的抑菌作用最強，噬菌體對沙門氏菌以外的細菌沒有明顯抑制作用；3）復配抑菌劑能顯著抑制樣品中TVB-N的增加，14 d后與空白對照相比TVB-N值降低了13.73 mg/100 g，其中雙乙酸鈉的抑制作用最強。結果表明，噬菌體、nisin及雙乙酸鈉復配劑在生三文魚沙門氏菌控制及防腐保鮮中具有良好應用前景。

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