復(fù)合微生物預(yù)處理玉米秸稈提高其厭氧消化產(chǎn)甲烷性能

黃開(kāi)明，趙立欣，馮 晶，姚宗路，于佳動(dòng)，羅 娟

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)劃設(shè)計(jì)研究院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)廢棄物能源化利用重點(diǎn)試驗(yàn)室，北京 100125）

0 引 言

中國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)作物秸稈資源豐富、種類多樣。其中，玉米秸稈年產(chǎn)量約為3.2億t，合1.6億t標(biāo)準(zhǔn)煤[1-3]。然而，每年產(chǎn)生的巨量玉米秸稈除了一小部分被用于造紙、紡織、基料、飼料和肥料外，每年約有1億t玉米秸稈被就地廢棄，這不僅造成了資源的嚴(yán)重浪費(fèi)，而且還會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的環(huán)境污染[4]。以玉米秸稈為原料進(jìn)行厭氧消化，不僅可以解決玉米秸稈因焚燒等處理方式所帶來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題，還可以為各類沼氣工程的運(yùn)行提供大宗原料來(lái)源。但玉米秸稈中含有大量難降解的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，不易被厭氧微生物所降解和利用，成為制約玉米秸稈為原料生產(chǎn)沼氣的一個(gè)瓶頸[5]。

玉米秸稈有著致密的組織結(jié)構(gòu)，抗分解能力強(qiáng)，在自然條件下，往往需要很長(zhǎng)時(shí)間才能被分解，因此如何加速玉米秸稈腐解，使其無(wú)害化、資源化，已成為國(guó)內(nèi)外研究的一個(gè)熱點(diǎn)[6-7]。綜合比較各種技術(shù)，利用微生物產(chǎn)生纖維素酶來(lái)分解和轉(zhuǎn)化纖維素，被認(rèn)為是纖維素利用的一個(gè)有效途徑[8]。要利用玉米秸稈為原料厭氧發(fā)酵生產(chǎn)沼氣，首先需對(duì)玉米秸稈進(jìn)行預(yù)處理，以解決玉米秸稈水解酸化問(wèn)題。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)玉米秸稈預(yù)處理的研究主要集中在擠壓、粉碎、揉搓、蒸汽爆碎、化學(xué)制劑處理等幾個(gè)方面[9]。但利用這些預(yù)處理方法處理玉米秸稈，存在能耗高、水耗大，易造成二次污染等諸多實(shí)際問(wèn)題。和這些技術(shù)相比，生物預(yù)處理具有一定的優(yōu)勢(shì)，生物預(yù)處理是利用具有生物活性的酶、單一菌株降解玉米秸稈，此方法具有使用能耗低、條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[10-13]。但生物酶、單一菌株往往只能降解玉米秸稈中的個(gè)別成分，降解效果并不十分理想。為此人們將目光轉(zhuǎn)向復(fù)合菌系，希望利用復(fù)合菌系中不同微生物之間的協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素類物質(zhì)的高效轉(zhuǎn)化與利用[14-19]。

目前，研究較多的可降解農(nóng)作物秸稈的微生物有黑曲霉（Aspergillus）、木霉（Trichoderma）、草酸青霉（Penicillium）和白腐真菌等[8]。黑曲霉、木霉、草酸青霉、白腐真菌分別為可利用不同底物如葡萄糖、丁酸、丙酸等碳水化合物高效降解纖維素和半纖維素的菌株。李硯飛等利用白腐真菌和木霉預(yù)處理玉米秸稈產(chǎn)沼氣研究，玉米秸稈中木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)由未處理秸稈的15.2%降低為 7.4%，纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)由 31.2%降低到20.1%，產(chǎn)氣量比未經(jīng)預(yù)處理秸稈提高11.95%[20]；張瑞等利用灰綠草酸青霉、米根霉、白腐菌、黃曲霉和螺孢菌預(yù)處理15 g的小麥秸稈，并投入沼氣罐中，在37 ℃條件下，進(jìn)行30 d的厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣研究，較空白對(duì)照組提升了181%[19]。

黑曲霉、木霉和草酸青霉都可分泌纖維素酶，這是一種復(fù)合酶，由外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等組成，這3種酶共同作用把纖維素降解成葡萄糖；黑曲霉、木霉和草酸青霉降解半纖維素的酶主要也有3種酶：內(nèi)切酶、外切酶和糖苷酶，這3種酶把半纖維素降解為單糖和糖醛酸[14]；白腐真菌是目前發(fā)現(xiàn)能同時(shí)分解植物聚合物的少數(shù)微生物之一，因能產(chǎn)生分解木質(zhì)素的過(guò)氧化物酶，所以它能分解秸稈中的纖維素和木質(zhì)素，且降解木質(zhì)素的能力優(yōu)于降解纖維素的能力[15]。本文利用黑曲霉、木霉、草酸青霉和白腐真菌 4株菌發(fā)酵底物的互補(bǔ)性，以期提高玉米秸稈的轉(zhuǎn)化效率，對(duì)其進(jìn)行混合培養(yǎng)，構(gòu)建了高效產(chǎn)乙酸復(fù)合菌系HK-4，通過(guò)優(yōu)化其混合培養(yǎng)條件，并將其應(yīng)用于沼氣厭氧發(fā)酵領(lǐng)域，以期實(shí)現(xiàn)玉米秸稈的高效利用與轉(zhuǎn)化，為玉米秸稈的資源化利用及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米秸稈：取自河北省張家口市農(nóng)場(chǎng)，自然晾干，粉碎至粒徑為0.7～1 cm，測(cè)得總固體TS（total solid）為89.63%，室溫儲(chǔ)藏備用。

玉米秸稈前處理微生物為黑曲霉（ACCC 30171）、木霉（ACCC 31490）、草酸青霉（ACCC 32576）、黃孢原毛平革菌（CICC 40299），其中，黑曲霉、木霉和草酸青霉購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACCC），黃孢原毛平革菌購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）；牛糞取自河北省三河市華夏畜牧。試驗(yàn)原料和接種物基本性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)原料和接種物基本性質(zhì)Table 1 Basic properties of experimental materials and inoculating substances

1.2 反應(yīng)儀器裝置

試驗(yàn)的整個(gè)過(guò)程分為微生物預(yù)處理階段和厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣階段，2個(gè)階段在2個(gè)不同的裝置內(nèi)進(jìn)行。微生物預(yù)處理試驗(yàn)階段試驗(yàn)裝置選用容積為2 L廣口瓶，管口用無(wú)菌過(guò)濾透氣封口膜密封，橡皮筋勒緊瓶口，固定在搖床中，在28 ℃、180 r/min的條件下進(jìn)行試驗(yàn)；厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣階段試驗(yàn)選用容積為750 mL的廣口瓶，發(fā)酵裝置固定在恒溫水池中，38 ℃靜置培養(yǎng)。

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、BSA124S萬(wàn)分之一電子分析天平（梅特勒托利多儀器有限公司）、DZF-6050干燥箱（上海索普儀器有限公司）、QYC-2102C生物培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、YXQ-LS-50S立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊儀器有限公司）、DR/5000紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）、便攜式pH計(jì)（SX-610，上海三信）、便攜式沼氣成分分析儀（Biogas check，Geotech，英國(guó)）、ANTOM 220型纖維素分析儀（北京正方興達(dá)科技發(fā)展有限公司，中國(guó)）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：稱取39 g固體的培養(yǎng)基粉末（DifcoTM Potato Dextrose Agar，BD公司）溶于1 L水中，121 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨 0.5 g/L、麩皮浸出液20 g/L、硫酸銨1.4 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、氯化鈣0.3 g/L、硫酸亞鐵0.005 g/L、硫酸錳0.001 6 g/L、硫酸鋅 0.001 4 g/L、氯化鈷 0.002 g/L，蒸餾水定容到1 000 mL（pH 值 6.8±0.2）[12]。

1.3.2 菌劑的制備

孢子懸浮液的制備：將以上菌種活化后移至PDA平板上，于28 ℃培養(yǎng)4～6 d，長(zhǎng)滿孢子后，用無(wú)菌生理鹽水將孢子沖洗至三角瓶中，三角瓶中加入滅菌玻璃珠，在200 r/min的振蕩器中震蕩30 min，取出，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，利用無(wú)菌蒸餾水調(diào)整至每種菌種的孢子數(shù)在108mL-1。復(fù)合菌劑的制備：將以上菌種的孢子懸浮液按照體積比為1:1:1:1的比例進(jìn)行混配，制成復(fù)合微生物菌系HK-4，復(fù)合微生物菌系每種真菌孢子數(shù)為108CFU/mL[13]。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

復(fù)合微生物菌系HK-4生長(zhǎng)曲線與發(fā)酵液pH值測(cè)定試驗(yàn)，在2 L廣角瓶中加入400 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，無(wú)菌透氣封口膜密封，橡皮筋扎緊瓶口，于121 ℃滅菌15 min，每個(gè)三角瓶接種菌液10 mL，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，在28 ℃恒溫條件下 190 r/min震蕩培養(yǎng)15 d，接種后每天測(cè)定發(fā)酵液的光密度（OD600）和pH值。

復(fù)合微生物菌系 HK-4預(yù)處理玉米秸稈試驗(yàn)設(shè)置微生物預(yù)處理組和空白對(duì)照組。在2 L廣角瓶中加入400 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，無(wú)菌透氣封口膜密封，橡皮筋扎緊瓶口，于121 ℃滅菌15 min；將玉米秸稈（0.7～1 cm）30 g，置于1 000 mL的廣口瓶中，橡皮筋扎緊瓶口，于121 ℃滅菌15 min，冷卻至室溫后，在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行混配操作。其中，微生物預(yù)處理組將滅菌玉米秸稈加入到滅菌培養(yǎng)基中，每個(gè)三角瓶接種菌液10 mL；空白對(duì)照組將滅菌玉米秸稈加到滅菌培養(yǎng)基中，2組試驗(yàn)每個(gè)處理組有3次重復(fù)。在28 ℃恒溫條件下 190 r/min震蕩培養(yǎng)15 d。接種后每天測(cè)定菌液生長(zhǎng)量可溶性化學(xué)需氧量、可溶性糖含量及總糖含量；每3天測(cè)定纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的殘余量[14]。

厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣階段的試驗(yàn)原料為微生物預(yù)處理過(guò)的玉米秸稈、以及未經(jīng)復(fù)合微生物菌系HK-4處理的玉米秸稈，2種秸稈分別撈出，放置烘箱中，110 ℃烘干至恒質(zhì)量，各稱取20 g；新鮮牛糞和秸稈，秸稈∶牛糞=3:1，TS為10%，發(fā)酵溫度為38 ℃，加水調(diào)節(jié)有效體積為0.8 L，進(jìn)行32 d中溫厭氧消化批次試驗(yàn)。同時(shí)設(shè)置未預(yù)處理玉米秸稈和牛糞混合組[15]。每組試驗(yàn)設(shè) 3個(gè)平行，厭氧消化過(guò)程中每天記錄產(chǎn)氣量和氣體成分，每天測(cè)定發(fā)酵液的pH值和產(chǎn)氣量等指標(biāo)。

1.5 分析方法

TS、VS測(cè)定參照美國(guó) APHA方法[16]。采用紫外分光光度法測(cè)定發(fā)酵液的光密度（OD600），使用便攜式 pH計(jì)監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程的pH值；采用排水集氣法收集氣體，每天定時(shí)記錄量筒測(cè)量管中排出的水量，即沼氣產(chǎn)量（mL）；使用便攜式沼氣成分分析儀測(cè)定沼氣中的甲烷體積分?jǐn)?shù)（%）；溶解性化學(xué)需氧量（soluble chemical oxygen demand，sCOD）的測(cè)定采用酸化水解液在4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液用COD測(cè)定儀測(cè)定；可溶性糖測(cè)定選用蒽酮硫酸法、總糖測(cè)定選用DNS法；纖維素、半纖維素、木質(zhì)素采用范式洗滌法。

基礎(chǔ)數(shù)據(jù)處理、顯著性差異分析基于Microsoft Office 2003軟件平臺(tái)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物預(yù)處理

2.1.1 復(fù)合微生物菌系HK-4生長(zhǎng)曲線與發(fā)酵液pH值

由圖1可見(jiàn)，接種后，復(fù)合菌系HK-4的生長(zhǎng)大致分為3個(gè)生長(zhǎng)階段，即快速增加、穩(wěn)定和降低3個(gè)階段性生長(zhǎng)階段。其中，第 0～5 d，曲線斜率最大，這一階段復(fù)合菌系HK-4處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD600值達(dá)到1.71，說(shuō)明該復(fù)合菌系適應(yīng)能力很強(qiáng)，細(xì)胞代謝旺盛，生物量增加量較快；第5～12 d，復(fù)合菌系生長(zhǎng)進(jìn)入緩慢増長(zhǎng)的穩(wěn)定期，增殖速度較第0～5 d時(shí)降低，OD由1.71緩慢增長(zhǎng)到 2.31；12 d以后，可能由于發(fā)酵培養(yǎng)基中復(fù)合菌系HK-4種間及種內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)的原因，加劇了食物競(jìng)爭(zhēng)、環(huán)境競(jìng)爭(zhēng)、空間競(jìng)爭(zhēng)，復(fù)合菌系進(jìn)入衰弱期，OD600值逐漸下降[17]。復(fù)合菌系培養(yǎng)液的pH值呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì)，經(jīng)過(guò)4 d的發(fā)酵，發(fā)酵液pH值由初始值7.96下降至6.79左右，表明復(fù)合菌系HK-4發(fā)酵初期產(chǎn)生酸類物質(zhì)，使pH值快速降低，5 d后發(fā)酵液的pH值穩(wěn)步提高到7.8左右，13 d時(shí)，pH值穩(wěn)定在8.1左右，整個(gè)微生物預(yù)處理過(guò)程中，pH值在6.79～8.28間浮動(dòng)，表明復(fù)合菌系HK-4具有良好的pH值自我調(diào)節(jié)能力和穩(wěn)定性，不會(huì)造成系統(tǒng)酸化現(xiàn)象[18]。

圖1 復(fù)合微生物菌系HK-4生長(zhǎng)曲線與發(fā)酵液pH值Fig.1 Growth curve and pH value of compound microbial strain HK-4

2.1.2 復(fù)合微生物菌系 HK-4預(yù)處理玉米秸稈發(fā)酵液sCOD的動(dòng)態(tài)變化

復(fù)雜有機(jī)物在厭氧消化過(guò)程中，各類揮發(fā)性有機(jī)酸是主要的代謝中間產(chǎn)物，也是完成產(chǎn)甲烷過(guò)程的重要前體基質(zhì)。本研究所得復(fù)合微生物菌系HK-4預(yù)處理玉米秸稈發(fā)酵液sCOD的變化趨勢(shì)如圖2所示。結(jié)果表明，培養(yǎng)的前4 d，培養(yǎng)體系的可溶性化學(xué)需氧量呈逐漸降低的趨勢(shì)。復(fù)合微生物接種初期，玉米秸稈中的可溶性有機(jī)物和培養(yǎng)基成分使得初始可溶性化學(xué)需氧值較高，達(dá)到8 210 mg/L；接種復(fù)合菌系后，微生物快速繁殖將培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)快速消耗，使得可溶性化學(xué)需氧量迅速減小，接種第1 天便迅速降低至6 467 mg/L，到第4 天，降低至4 823 mg/L，呈現(xiàn)出單邊下降的趨勢(shì)，且下降速率較快。另外，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，由于微生物的呼吸作用，底物降解過(guò)程中產(chǎn)生的酸會(huì)被轉(zhuǎn)化成 CO2，從體系中排除，最終也會(huì)導(dǎo)致可溶性化學(xué)需氧量的下降[18]。第4～15 天，培養(yǎng)體系的可溶性化學(xué)需氧量趨向于平穩(wěn)，此階段培養(yǎng)體系中易于降解的可溶性有機(jī)物基本降解掉，培養(yǎng)體系中的微生物通過(guò)產(chǎn)生胞外酶釋放到培養(yǎng)體系中，作用于玉米秸稈，使得秸稈中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等難降解的有機(jī)物降解成可溶性多糖，菌液中的復(fù)合菌系將其利用掉，從而形成這一階段的 sCOD呈現(xiàn)出總體平穩(wěn)，波浪往復(fù)的可溶性化學(xué)需氧量變化情況[18]。

圖2 復(fù)合微生物菌系HK-4預(yù)處理玉米秸稈發(fā)酵液可溶性化學(xué)需氧量動(dòng)態(tài)Fig.2 Dynamics of soluble COD in pretreatment of corn straw fermentation with composite microbial strain HK-4

2.1.3 復(fù)合微生物菌系 HK-4預(yù)處理玉米秸稈發(fā)酵液可溶性糖含量及總糖含量的動(dòng)態(tài)

由圖3可知，復(fù)合微生物菌系HK-4預(yù)處理玉米秸稈發(fā)酵液可溶性糖含量呈波浪形變化趨勢(shì)，發(fā)酵培養(yǎng)第 3天，可溶性糖質(zhì)量濃度升高至9.71μg/mL，隨后迅速降低，然后呈波浪形降低趨勢(shì)，培養(yǎng)15 d結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液可溶性糖質(zhì)量濃度為1.48μg/mL；復(fù)合微生物菌系HK-4發(fā)酵液總糖含量隨著預(yù)處理進(jìn)行逐漸降低，3 d后趨于穩(wěn)定。這是由于在發(fā)酵過(guò)程中的0～10 d，復(fù)合菌系HK-4中的組成菌株發(fā)生交替生長(zhǎng)發(fā)酵，協(xié)同分解玉米秸稈底物，將其降解成可溶性糖，可溶性糖又被復(fù)合菌系利用，從而發(fā)酵液中的可溶性糖含量呈現(xiàn)出先上升，然后波浪狀上下波動(dòng)的形態(tài)，預(yù)處理第10～15 天期間，由于易于降解的纖維素、半纖維素成分基本降解完成，加之復(fù)合菌系也由穩(wěn)定期逐漸進(jìn)入凋亡期，代謝產(chǎn)物積累，菌種活力下降，因此，這一階段的發(fā)酵液總糖含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。發(fā)酵第3天總糖質(zhì)量濃度由初始值0.49 mg/mL降低至0.16 mg/mL，之后的第3～15天趨于穩(wěn)定。復(fù)合微生物菌系HK-4將玉米秸稈分解過(guò)程中產(chǎn)生的糖逐漸消耗，而隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)易分解的纖維素物質(zhì)越來(lái)越少，最終導(dǎo)致總糖濃度趨于穩(wěn)定[20]。

圖3 復(fù)合微生物菌系HK-4預(yù)處理玉米秸稈發(fā)酵液可溶性糖質(zhì)量濃度及總糖質(zhì)量濃度的動(dòng)態(tài)Fig.3 Dynamics of soluble sugar concentration and total sugar mass concentration in corn straw fermentation broth pretreated by composite microbial strain HK-4

2.1.4 復(fù)合微生物菌系 HK-4預(yù)處理玉米秸稈木質(zhì)纖維素降解過(guò)程分析

由圖4可知，復(fù)合微生物菌系HK-4預(yù)處理過(guò)程中木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的含量都呈現(xiàn)出減少。從結(jié)構(gòu)角度來(lái)看，木質(zhì)素是由對(duì)羥苯基丙烷、愈創(chuàng)木基丙烷和紫丁香基丙烷 3種單體組成的復(fù)雜芳香族高聚體[21]，屬于非水溶性難降解物質(zhì)，說(shuō)明復(fù)合微生物菌系產(chǎn)生了能夠降解木質(zhì)素的胞外酶，作用于玉米秸稈；纖維素是由D-吡喃葡萄糖環(huán)彼此經(jīng)β-1，4-糖苷鍵，以 C1椅式構(gòu)象聯(lián)結(jié)而成的線形高分子化合物，具有很高的結(jié)晶度和聚合度，同時(shí)還被木質(zhì)素包裹著，與纖維素相比，半纖維素結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單，由木糖、甘露糖和半乳糖等組成[22]，屬于比較容易降解的物質(zhì)，說(shuō)明復(fù)合微生物菌系產(chǎn)生了能夠降解纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的胞外復(fù)合酶系，作用于玉米秸稈。李硯飛等利用白腐菌和木霉菌組成的復(fù)合菌進(jìn)行玉米秸稈微生物預(yù)處理，纖維素的降解率為35.6[23]；姜潔等利用白腐真菌預(yù)處理玉米秸稈，纖維素的降解率為58.5%[12]。而本試驗(yàn)研究，微生物預(yù)處理組預(yù)處理纖維素降解率為64.52%，半纖維素降解率為51.06%，而木質(zhì)素較難被厭氧微生物利用，它的降解率為3.89%。

圖4 復(fù)合微生物菌系HK-4預(yù)處理玉米秸稈纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量Fig.4 Content of cellulose, hemicelluloses and lignin in corn straw treated by composite microbial strain HK-4

2.2 復(fù)合微生物菌系HK-4預(yù)處理玉米秸稈對(duì)產(chǎn)氣的影響

2.2.1 產(chǎn)氣潛力

由圖5可以看出，玉米秸稈復(fù)合微生物菌系HK-4預(yù)處理組和空白對(duì)照組厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣階段，氣潛力差別較大。復(fù)合微生物菌系HK-4預(yù)處理組和未處理組分別在厭氧發(fā)酵第4天及第8天進(jìn)入產(chǎn)氣高峰，峰值分別為287和249 mL/d，產(chǎn)氣主要集中在第4～24 天及第6～21 天之間，產(chǎn)氣高峰期，復(fù)合微生物菌系HK-4預(yù)處理組的日產(chǎn)氣量維持在 280 mL/d，未處理組日產(chǎn)氣量維持在240 mL/d水平。另外，復(fù)合微生物菌系HK-4預(yù)處理組產(chǎn)氣過(guò)程中呈現(xiàn)出多個(gè)不規(guī)則產(chǎn)氣高峰，原因可能是由于發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)揮發(fā)性脂肪酸酸(volatile fatty acids)的產(chǎn)生速度大于其消耗速度時(shí)，導(dǎo)致?lián)]發(fā)性脂肪酸累積，從而影響了原料的產(chǎn)氣效果，之后隨著VFA的消耗，解除了揮發(fā)酸所產(chǎn)生的抑制，復(fù)雜有機(jī)物逐漸被厭氧菌群消化，產(chǎn)氣能力恢復(fù)，產(chǎn)氣量升高[24]。但由于復(fù)雜有機(jī)物降解難易程度不同，當(dāng)大分子有機(jī)質(zhì)水解、產(chǎn)酸的速率與產(chǎn)甲烷速率不能保持平衡時(shí)，則造成沼氣日產(chǎn)氣量呈現(xiàn)上下起伏狀的變化[25]。

圖5 厭氧發(fā)酵日產(chǎn)氣量Fig.5 Anaerobic fermentation of daily gas production

經(jīng)復(fù)合微生物菌系 HK-4預(yù)處理組和未經(jīng)處理的玉米秸稈與牛糞混合厭氧消化32 d，累積產(chǎn)氣量（見(jiàn)圖6）分別為7 364和5 347 mL，差異極顯著（P＜0.01＝；單位干質(zhì)量產(chǎn)氣量為294.6和213.9 mL/g。李硯飛等利用白腐菌和木霉菌組成的復(fù)合菌進(jìn)行玉米秸稈微生物預(yù)處理，產(chǎn)氣量可比未經(jīng)預(yù)處理秸稈的產(chǎn)氣量提高11.95%[23]；萬(wàn)楚筠等利用包含有枯草芽胞桿菌（Bacillus Subtilis）、地衣芽胞桿菌（Bacillus Licheniformis）、克魯斯酵母菌（Canadian krusei）、變色栓菌（Trametes versicolor）和黃孢原毛平革菌（Phaerochaete chrysosporium）等微生物菌種的秸稈高效降解混合菌劑處理油菜秸稈，發(fā)現(xiàn)預(yù)處理后的秸稈累計(jì)產(chǎn)氣量提高了17.8%[26]。本研究微生物預(yù)處理組比未處理組高了27.4%，產(chǎn)氣高峰期甲烷體積分?jǐn)?shù)提高了33%，效果明顯。此外，由圖6也可看出微生物預(yù)處理組產(chǎn)氣量在厭氧消化前24天增長(zhǎng)迅速，24 d之后逐漸變慢，表明產(chǎn)氣高峰結(jié)束。由此可見(jiàn)，復(fù)合微生物菌系HK-4預(yù)處理過(guò)的玉米秸稈累積產(chǎn)氣量明顯提高，消化速率也得到大幅提升。

2.2.3 產(chǎn)氣甲烷含量

各試驗(yàn)組日產(chǎn)甲烷體積分?jǐn)?shù)變化如圖 7所示。在厭氧消化過(guò)程中，2個(gè)試驗(yàn)組甲烷體積分?jǐn)?shù)的波動(dòng)規(guī)律基本一致，都呈現(xiàn)出先緩慢增加后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)[24]。復(fù)合微生物菌系HK-4預(yù)處理組，厭氧消化的第4天，CH4體積分?jǐn)?shù)就快速提升到40%以上，之后20 d在45%～53%之間波動(dòng)，說(shuō)明此時(shí)段營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足，消化體系內(nèi)甲烷菌的活性得到了很大的提升。而未預(yù)處理組測(cè)得的 CH4含量相對(duì)較低，到第6天才升到36.7%以上，之后20 d，基本在26%～36%之間變動(dòng)，隨后開(kāi)始下降。與復(fù)合微生物菌條HK-4預(yù)處理組相比，空白對(duì)照組發(fā)酵產(chǎn)氣速率增長(zhǎng)緩慢，原料轉(zhuǎn)化及甲烷產(chǎn)生率低，秸稈利用效率差[27]。

圖6 厭氧發(fā)酵累積產(chǎn)氣量Fig.6 Accumulative gas production in anaerobic fermentation

圖7 厭氧發(fā)酵甲烷含量動(dòng)態(tài)Fig.7 Methane content dynamics in anaerobic fermentation

3 結(jié) 論

玉米秸稈經(jīng)復(fù)合微生物菌系HK-4在28 ℃處理14 d，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解率分別可達(dá)64.52%、51.06%和3.89%，對(duì)復(fù)合微生物菌系HK-4處理過(guò)的玉米秸稈進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣研究，發(fā)現(xiàn)復(fù)合微生物菌系HK-4預(yù)處理過(guò)的玉米秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣，累積產(chǎn)氣量明顯提高，經(jīng)過(guò) 32 d的厭氧發(fā)酵，累積產(chǎn)氣量提高了27.4%，產(chǎn)氣高峰期甲烷含量提高了33%。

綜上，復(fù)合微生物菌系 HK-4對(duì)玉米秸稈中的纖維素、半纖維素?fù)碛泻芎玫乃庑Ч瑢?shí)現(xiàn)了在較低溫度下獲得較高的秸稈降解率，使用復(fù)合微生物菌系HK-4預(yù)處理過(guò)的玉米秸稈用于厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣，可有效提高日產(chǎn)氣量及甲烷含量，是一種經(jīng)濟(jì)高效的預(yù)處理方法，為寒區(qū)秸稈資源化利用提供了新的微生物資源和方法。

[1]國(guó)家統(tǒng)計(jì)局. 2017年中國(guó)統(tǒng)計(jì)年鑒[M]. 北京：中國(guó)統(tǒng)計(jì)出版社，2017.

[2]陳羚，趙立欣，董保成，等. 我國(guó)秸稈沼氣工程發(fā)展現(xiàn)狀與趨勢(shì)[J]. 可再生能源，2010，28(3)：145－148.Chen Ling, Zhao Lixin, Dong Baocheng, et al. The status and trends of the development of biogas plants for crop straws in China[J]. Renewable Energy Resources, 2010, 28(3): 145－148.(in Chinese with English abstract)

[3]葉安珊. 我國(guó)農(nóng)業(yè)廢棄物資源化問(wèn)題探討[J]. 產(chǎn)經(jīng)評(píng)論，2008(6)：29－31.Ye Anshan. Discussion on the problem of agricultural waste resources in China[J]. Forum on Industrial Economy, 2008(6):29－31. (in Chinese with English abstract)

[4]熊菊芬. 農(nóng)作物秸稈資源化利用效果試驗(yàn)[J]. 農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2017，37(14)：51－53.Xiong Jufen. Experiment on utilization effect of crop straw resource utilization[J]. Agriculture and Technology, 2017,37(14): 51－53. (in Chinese with English abstract)

[5]Neshat S A, Mohammadi M, Najafpour G D, et al. Anaerobic co-digestion of animal manures and lignocellulosic residues as a potent approach for sustainable biogas production[J].Renewable & Sustainable Energy Reviews, 2017, 79: 308－322.

[6]Awasthi S K, Joshi R, Dhar H, et al. Improving methane yield and quality via co-digestion of cow dung mixed with food waste[J]. Bioresource Technology, 2017, 251: 259.

[7]Fu P, Yi W, Li Z, et al. Evolution of char structural features during fast pyrolysis of corn straw with solid heat carriers in a novel V-shaped down tube reactor[J]. Energy Conversion &Management, 2017, 149: 570－578.

[8]Bao L, Huang Q, Chang L, et al. Screening and characterization of a cellulase with endocellulase and exocellulase activity from yak rumen metagenome[J]. Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic, 2011, 73(1): 104－110.

[9]Patinvoh R J, Osadolor O A, Chandolias K, et al. Innovative pretreatment strategies for biogas production[J]. Bioresource Technology, 2016, 224:13－24.

[10]張紅蓮，郭愛(ài)蓮，何鈞，等. 采用階段處理和多菌種固態(tài)發(fā)酵玉米秸稈的研究[J]. 西北大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，34(6)：691－694.Zhang Honglian, Guo Ailian, He Yun, et al. A study on utilizing stage process and the multi-strains solid state fermentation for corn straw[J]. Journal of Northwest University: Natural Science Edition, 2004, 34(6): 691－694.(in Chinese with English abstract)

[11]Wang M, Zhou J, Yuan Y X, et al. Methane production characteristics and microbial community dynamics of monodigestion and co-digestion using corn stalk and pig manure[J].International Journal of Hydrogen Energy, 2017, 42(8):4893－4901.

[12]姜潔. 玉米秸稈微生物預(yù)處理工藝篩選[D]. 重慶：西南大學(xué)，2010.Jiang Jie. Screening of Microbial Pretreatment Technology for Maize Straw[D]. Chongqing: Southwestern University,2010. (in Chinese with English abstract)

[13]黃永春，彭祎，譚悠久. 鏈霉菌單孢子懸液制備方法：CN101418278[P]. 2009.

[14]任南琪，馬方. 污染控制微生物學(xué)[M]. 哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)出版社，2002.

[15]陳子愛(ài)，鄧小晨. 微生物處理利用秸桿的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)沼氣，2006，24(3)：31－35.Chen Ziai, Deng Xiaochen. Progress in microbiologic utilization technology of crop straw[J]. China Biogas, 2006,24(3): 31－35. (in Chinese with English abstract)

[16]APHA. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater[M]. American Public Health Association,Washington, DC, USA, 2005.

[17]胡寶龍，林勇. 微生物生長(zhǎng)量測(cè)定系統(tǒng)[J]. 試驗(yàn)技術(shù)與管理，1995(4): 49－50.Hu Baolong, Lin Yong. Microbiological growth measurement system[J]. Experimental Technology and Management, 1995(4):49－50. (in Chinese with English abstract)

[18]青格爾，高聚林，于曉芳，等. 玉米秸稈低溫高效降解復(fù)合菌系GF-20的菌種組成及降解穩(wěn)定性研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，49(3)：443－454.Qing Geer, Gao Julin, Yu Xiaofang, et al. Function and composition stability of a composite microbial system GF-20 with efficient corn stalk decomposition under low temperature[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2016, 49(3): 443－454. (in Chinese with English abstract)

[19]張瑞，張熠依，田昆鵬，等. 秸稈沼氣發(fā)酵預(yù)處理微生物菌劑的篩選與特征研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014(11)：3334－3337.Zhang Rui, Zhang Yiyi, Tian Kunpeng, et al. Research on the microbial agents for pretreatment of biogas fermentation[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2014(11): 3334－3337. (in Chinese with English abstract)

[20]王寒. 玉米秸稈的青貯及水解方法的研究[D]. 天津大學(xué),2012.Wang Han. The Research on Silage and Hydrolysis Methods of Corn Stalk[D]. Tianjin: Tianjin University, 2012. (in Chinese with English abstract)

[21]Wang H, Frits P D V, Jin Y. A win-win technique of stabilizing sand dune and purifying paper mill black-liquor[J].Acta Scientiae Circumstantiae (English Edition), 2009, 21(4):488－493.

[22]李海紅，王巧，袁月，等. 一組高溫混合菌對(duì)木質(zhì)素纖維素的降解[J]. 西安工程大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，27(1)：83－87.Li Haihong, Wang Qiao, Yuan Yue, et al. A high-temperature composite microbe for degrading of lignin and cellulose[J].Journal of Xi’an Polytechnic University, 2013, 27(1): 83－87.(in Chinese with English abstract)

[23]李硯飛，黃亞麗，代樹(shù)智，等. 復(fù)合微生物預(yù)處理玉米秸稈產(chǎn)沼氣的試驗(yàn)研究[J]. 可再生能源，2013，31(5)：80－83.Li Yanfei, Huang Yali, Dai Shuzhi, et al. Experimental study of compound microoriganism pre-treatment to enhance straw anaerobic digestion[J]. Renewable Energy Resources, 2013,31(5): 80－83. (in Chinese with English abstract)

[24]陳中玉. 玉米秸稈預(yù)處理及與剩余污泥混合厭氧消化研究[D]. 天津：天津大學(xué)，2010.Chen Zhongyu. Pretreatment of Corn Stalk and Anaerobic Digestion with Excess Sludge[D]. Tianjin: Tianjin University,2010. (in Chinese with English abstract)

[25]Zhou S, Zhang Y, Dong Y. Pretreatment for biogas production by anaerobic fermentation of mixed corn stover and cow dung[J]. Energy, 2012, 46(1): 644－648.

[26]萬(wàn)楚筠，黃鳳洪，劉睿，等. 微生物預(yù)處理油菜秸稈對(duì)提高沼氣產(chǎn)量的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2010，26(6)：267－271.Wan Chuyun, Huang Fenghong, Liu Rui, et al. Effect on increasing biogas production using rape straw by microbiological pretreatment[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2010, 26(6): 267－271. (in Chinese with English abstract)

[27]魏域芳，李秀金，劉研萍，等. 不同預(yù)處理玉米秸稈與牛糞混合厭氧消化產(chǎn)氣性能比較[J]. 中國(guó)沼氣，2016，34(2)：36－40.Wei Yufang, Li Xiujin, Liu Yanping, et al. Comparison of biogas production performance of anaerobic digestion of corn straw and cow manure with different pretreatment[J]. China Biogas, 2016, 34(2): 36－40. (in Chinese with English abstract)