茶葉對白色念珠菌體外抑菌活性的實驗研究

鄭明 黃晶晶 于皓 程輝

1. 350004 福州， 福建省高校口腔醫學重點實驗室， 福建醫科大學附屬口腔醫院；2. 福建醫科大學口腔醫學院

白色念珠菌(Candidaalbicans)是一種寄生在人體的機會性致病真菌。近年來，隨著類固醇激素等廣泛應用，使臨床上念珠菌感染日益增多[1-2]。研究表明65%以上義齒佩戴者患有念珠性口炎[3]，而白色念珠菌與念珠菌性口炎的發生密切相關[4]，其在患者的義齒菌斑中檢出率81.7%，是主要的致病菌[5]。據調查，白色念珠菌也是臨床感染率最高的真菌[6]。

茶葉作為純天然的藥物，飲茶的好處與人類健康的關系已有多方面研究。目前，對于茶葉的抗氧化活性[7]、抗癌活性[8-9]、抗微生物活性包括抗菌和抗病毒活性已廣泛有報道[10-14]。關于茶葉抗真菌活性報道較有限。

據研究，綠茶的兒茶素，包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)具有抗真菌活性[15]。EGCG為一種抗葉酸化合物，可以擾亂白色念珠菌的葉酸代謝，從而達到抑真菌作用[16-17]。Sitheeque等[18]指出，紅茶多酚(兒茶素和茶黃素)也顯示抑制白色念珠菌能力。目前較多的究局限在對茶葉中的某一成分進行抗真菌研究，而以簡單方法制取茶浸泡液對抗真菌是否有效鮮有報道。

同時，現有的義齒清潔劑對抗白色念珠菌效果有限[19]。所以，本實驗通過3 種不同濃度的茶浸泡液對白色念珠菌的抑菌活性進行初步研究，為進而研究茶浸泡液是否能對義齒表面上真菌膜有清除作用做準備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 真菌株與茶葉 白色念珠菌標準菌株(ATCC90029，上海瑞楚生物科技有限公司)；白茶(AnG,浙江安吉)、鐵觀音(TM，福建安溪)、大紅袍(HM，福建武夷山)。

1.1.2 主要試劑與儀器 培養基：瓊脂粉(BIOSHARP)；液體沙氏培養基(青島海博)；革蘭染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；紫外分光光度計(北京鼎國昌盛生物技術有限公司)。

1.2 方法

取20 g茶葉放入100 ml一級水(80～85℃)浸泡10 min，濾紙過濾，使用0.2 μm過濾器獲得200 mg/mL無菌茶浸泡液。

采用對倍稀釋法，用等量的沙氏液體培養基和等量的茶浸泡液混合配制成系列濃度對倍遞減的茶浸泡液，再分別取上述系列濃度的茶浸泡液1 ml與 9 ml沙氏瓊脂培養基混合后傾注平板。茶浸泡液平板濃度：20、10、5、2.5、1.25 mg/mL。每組平板樣本量為10 個。

菌懸液配制：將白色念珠菌接種于沙氏瓊脂培養基，恒溫培養箱37 ℃培養48 h。挑取部分菌落革蘭染色后，光學顯微鏡下觀察菌落的形態，鏡檢為純培養后挑取純培養單菌落接種在沙氏液體培養基內，恒溫搖床28 ℃，轉速180 r/min培養24 h。離心(3 500 r/min，4 ℃，10 min)，棄上清液，PBS洗滌3 次。最后沉淀物用PBS稀釋，配制104CFU/mL白色念珠菌菌懸液備用。取5 μl菌懸液分別點種于所有平皿表面，放入恒溫培養箱在 37 ℃條件下培養48 h后，記錄觀察結果。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行分析，茶浸泡液抗菌活性采用單因素方差分析以及兩兩比較(以α=0.05作為顯著性檢驗水平)。兩兩比較采用最小顯著差數法(LSD法)。

2 結 果

以蒸餾水平板為空白對照組，除了10 mg/mL HM浸泡液平板菌落計數大于蒸餾水外，其余茶浸泡液平板均小于空白組。但只有10 mg/mL AnG浸泡液(P=0.025), 2.5 mg/mL HM浸泡液(P=0.046)與空白組之間相比有統計學意義，對白色念珠菌有抑制作用，其余茶浸泡液與空白組相比無統計學意義(表 1)。

組別平板濃度(mg/mL)細菌計數(1×104CFU/mL)空白組1.05±0.40AnG1.250.93±0.18AnG2.50.92±0.25AnG50.90±0.19AnG100.78±0.19①AnG200.97±0.18TM1.250.89±0.16TM2.50.95±0.31TM50.85±0.15TM100.80±0.26TM200.82±0.31HM1.250.83±0.20HM2.50.79±0.20①HM50.95±0.28HM101.10±0.31HM201.01±0.21

注： 與空白組比較，①P<0.05

3 討 論

調查結果顯示念珠菌感染占真菌感染的73.4%，其中白色念珠菌感染最為常見[20]。

本研究選擇未發酵綠茶類中的安吉白茶，半發酵烏龍茶類中的鐵觀音、大紅袍作為研究對象。選擇這3 種茶葉是Chen等[21]對23 種茶浸泡液抗白色念珠菌活性進行研究，發現這3 種茶葉有一定的抗真菌活性。

為尋找對義齒表面上真菌膜有清除作用的茶浸泡液，本實驗對這3 種茶葉的抗菌性進一步驗證。與Chen等[21]采用的研究方法不同，采用藥物敏感實驗瓊脂稀釋法，并嘗試更多不同茶浸泡液濃度進行抗白色念珠菌實驗。

實驗設置1.25、2.5、5、10、20 mg/mL 5 種跨度較大等比系列茶葉濃度，試圖找到抑制白色念珠菌的最佳茶葉濃度。本實驗研究證實10 mg/mL AnG浸泡液, 2.5 mg/mL HM浸泡液對白色念珠菌有抑制作用，其余茶浸泡液及不含茶浸泡液對白色念珠菌的生長無顯著影響。 Chen等[21]的實驗結果這3 種茶葉在1.25 mg/mL時達到50%白色念珠菌抑制率。推測可能是因為采用的研究方法不一樣，該學者采用液體法，本實驗采用瓊脂稀釋法，以及茶浸泡液制取方法不一樣導致結果差異。

通過本研究了解到茶葉浸泡液對白色念珠菌有一定抑制作用，喝茶或用茶清洗口腔，可能有助于減少口腔真菌感染。茶提取物可能是潛在義齒消毒產品的原材料。另外，茶浸泡液對白色念珠菌的抑菌作用與濃度有關，且抑菌能力不隨濃度增加而增強。可對不同濃度的茶浸泡液抑菌活性進一步研究。