SMAS修飾的PEGDA載電凝膠對MC3T3-E1細胞增殖和分化的影響

馬廷廷 張漫 朱佳妮 王衛衛 劉杰 談飛

266003， 青島大學附屬醫院口腔修復科

PEGDA凝膠的內部結構與天然細胞基質(ECM)相似，已被廣泛應用于生物醫學領域[1-2]。但因其本身的生物惰性，導致細胞在凝膠表面難以粘附。隨著研究的深入，諸多學者發現材料表面負電荷可以促進細胞在材料表面的粘附。甲基丙烯酸磺酸鈉(SMAS)是含有穩定負電荷的小分子，能夠保證修飾后材料表面的電量。本研究用不同濃度的SMAS修飾PEGDA凝膠，研究材料表面電荷對細胞增殖和分化的影響。

1 材料與方法

1.1 SMAS修飾凝膠的制備

載電凝膠的制備見表 1。將凝膠前體溶液混勻后滴至無菌玻璃板上，用365 nm紫外線光固化燈照射15～20 min使其完全固化，制成樣品，每組6 塊。

表 1 不同濃度SMAS修飾凝膠的制備

1.2 SMAS修飾凝膠的化學結構分析

將樣品凍干24 h，利用紅外光譜 FTIR分光儀分析不同濃度SMAS修飾的 PEGDA 凝膠化學結構的變化，得出SMAS接枝量的差異。

1.3 SMAS修飾凝膠的Zeta電位測定

將各組樣品于三蒸水中浸泡48 h，用研缽將溶脹的凝膠研磨成細小顆粒，37 ℃真空干燥過夜，各組稱取5 mg，重新溶解至三蒸水，混勻后利用Zeta電位儀測量各組凝膠Zeta電位。

1.4 細胞增殖情況測定

常規培養MC3T3-E1細胞，將MC3T3-E1細胞懸液以1×105密度接種于凝膠表面。在1、 3、 5 d用CCK8法，記錄各組樣本A值。

1.5 細胞ALP活性的影響

細胞在凝膠表面誘導培養后，分別于7、 10、 14 d， 利用ALP檢測試劑盒檢測各組細胞的ALP活性。

1.6 細胞成骨分化相關基因檢測

在各組凝膠表面接種細胞。待細胞覆蓋凝膠表面95%時，換成骨誘導培養基。分別于7、 14、 21 d， 提取各組樣本RNA，采用qRT-PCR檢測成骨相關基因表達水平。相關相引物序列見表 2。

表 2 成骨相關引物序列表

1.7 鈣鹽含量檢測

第21 天，用茜素紅染色的方法對各組水凝膠表面細胞的鈣鹽含量做定量分析。

2 結 果

2.1 SMAS修飾凝膠的化學結構分析

FTIR光譜如圖1所示。SMAS成功接枝到PEGDA主鏈上，在1 105 cm-1處出現一個新的波峰，且隨著SMAS濃度的增加波峰逐漸增強。

圖 1 不同濃度SMAS小分子修飾的PEGDA凝膠表面的傅立葉紅外光譜分析

2.2 SMAS修飾凝膠Zeta電位分析

圖 2為Zeta電位絕對值，隨著SMAS濃度的增加，凝膠所攜的負電荷的電量也明顯增加。

2.3 SMAS修飾凝膠對MC3T3-E1細胞增殖的影響。

CCK-8結果表明，在各個時間點，凝膠表面的MC3T3-E1細胞增殖活性均不斷增加(圖 3)。

2.4 SMAS修飾凝膠對MC3T3-E1細胞ALP活性的影響

結果表明，隨著SMAS濃度的提高，凝膠表面細胞的ALP相對活性不斷增強(圖 4)。

2.5 SMAS修飾凝膠表面MC3T3-E1細胞成骨相關基因的檢測

結果如圖 5，COLI和OC在HG200組表達水平均明顯高于HG0組(P<0.05)。在成骨相關生長因子方面，在各個時間點，BMP-2、 TGFβ1和Runx-2在HG200組的表達水平均明顯高于HG0組(P<0.05)；而在第21 天， HG100組凝膠表面細胞的成骨生長因子表達水平也明顯高于HG0組(P<0.05)，且差異具有統計學意義。

2.6 SMAS修飾凝膠對MC3T3-E1細胞鈣鹽含量的影響

茜素紅染色結果如圖 6所示，隨著SMAS濃度的增加，染色的礦化結節數量逐漸增加，HG200組深色區域幾乎覆蓋整個凝膠表面。半定量分析結果表明(圖 6E)，HG100和HG200組鈣鹽含量明顯高于HG0組(P<0.05)，差異具有統計學意義。

3 討 論

SMAS小分子一端帶有穩定負電荷，另一端含有2-甲基丙烯酰基，該基團可以與聚合物中的多種基團發生反應，從而接枝到聚合物主鏈上。FTIR結果顯示，在1 105 cm-1處的波峰不斷增強，該波峰是由SMAS的羧酸基團引發的，證明SMAS成功接枝到PEGDA凝膠的主鏈上。同時凝膠表面電荷量也明顯增加。在本研究中，發現凝膠表面電荷能夠有效促進細胞的增殖以及成骨相關標志性蛋白和生長因子的表達，說明表面電荷能夠有效促進細胞的成骨分化。ALP是成骨早期標志性蛋白之一，對早期骨基質礦化具有重要影響。 COLⅠ成骨中期標志性蛋白之一，能夠與ECM中多種非膠原蛋白結合并構成骨基質的骨架[3]。OC是由成熟的成骨細胞分泌的成骨晚期標志性蛋白之一，能夠促進羥基磷灰石晶體的生成，對骨基質的礦化具有調節作用[4-6]。BMP-2和TGFβ1是當前公認的具有骨誘導作用的生長因子之一[7]。大量研究表明， 2 種生長因子具有共協調作用，能夠有效誘導骨祖細胞的募集，促進骨祖細胞的增殖和成骨分化。Runx-2是細胞成骨分化過程中一個重要的逆轉錄因子，它在礦化的多個時期發揮調節作用，在成熟的骨組織中高度表達[8]。

圖 2 SMAS修飾水凝膠Zeta電位絕對值 圖 3 SMAS修飾水凝膠表面細胞增殖檢測 圖 4 SMAS修飾水凝膠表面細胞ALP活性檢測

圖 5 SMAS修飾凝膠表面細胞成骨分化相關基因RT-PCR結果半定量分析

圖 6 各組凝膠表面的茜素紅染色結果

本實驗的結果表明，HG100、HG200組凝膠能夠有效促進細胞的增殖和分化而這種促進作用主要與材料表面電量有關。因此，載電凝膠是一種前景良好的骨組織工程支架材料。