TiF4溶液對脫礦牙釉質再礦化作用的實驗研究

汪鵬 高江紅 梁爽 高震 阮建平

齲病是牙體硬組織在以細菌為主的多因素作用下發生的慢性進行性破壞的感染性疾病，其患病率高、危害范圍廣[1]。齲病的發展實質上是脫礦與再礦化作用失衡，牙體硬組織持續脫礦、喪失的過程。齲病傳統的概念是"有洞為齲"，然而近年來學界認為，釉質表面形成白斑即可診斷為早期齲，稱之為白斑齲[2]，白斑齲具有可逆性。基于仿生修復的理念，調節牙釉質脫礦和再礦化的平衡方向，促進釉質再礦化，是治療早期齲的首選方向。

氟化物可以預防齲病已經被廣泛證實[3]。唾液中即使低至ppm水平的氟化物也可以改變脫礦與再礦化的平衡，影響齲損發展[4-5]。傳統氟化物如氟化鈉(NaF)可以在牙釉質表面形成CaF2沉淀層，從而形成氟離子庫，氟參與形成羥基磷灰石或氟磷灰石，降低了牙釉質的溶解性，并提高了其抗酸蝕的能力。含多價金屬離子的氟化物如四氟化鈦(TiF4)亦已被多名學者的研究[6-7]證實具有降低脫礦，抑制齲損發展的作用。其保護作用可能與形成抗酸的表層，增加氟的吸收量及鈦與羥基磷灰石晶體相結合3 方面有關[8]。關于TiF4的多數研究中，TiF4溶液的濃度介于1%～4%之間。但是，究竟哪個濃度在促進再礦化方面的作用更佳還缺乏有效的比較研究。

本實驗擬比較不同濃度的TiF4溶液對脫礦牙釉質的再礦化作用，篩選出最適宜的作用濃度，并初步探討其可能機制，為臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

四氟化鈦TiF4(Sigma-Aldrich公司，美國)；氟化鈉NaF(天津紅巖試劑廠)；SYJ-160慢速金剛石切割機(沈陽科晶有限公司)；HXD-1000TM維式顯微硬度計(上海泰明光學儀器有限公司)；Micro CT(YXLON，德國)。

1.2 試件制備

收集新鮮拔除的人第三磨牙，選擇無齲、無白斑、無裂紋、無氟牙癥或其他發育畸形的健康牙齒，4 ℃去離子水中保存。牙齒用蠟塊包埋，SYJ-160慢速金剛石切割機流水冷卻下切出大小為3 mm×2 mm×1.6 mm的牙釉質塊，樹脂包埋，流水下依次用600#, 1200#, 2500#和 4000#水砂紙打磨拋光，磨除約100 μm厚度。

采用HXD-1000TM維氏顯微硬度計，載荷為50 g，保荷時間為15 s測定試件表面顯微硬度(surface micro hardness，SMH)，在每個試件的拋光面測量5 個點，每點相距100 μm。計算其SMH平均值，并挑選SMH在299.4～353.3范圍內的60 個試件備用。

用抗酸指甲油封閉拋光面的1/3以及其他表面，留出2 mm×2 mm的開窗區。將60 個牙釉質試件隨機分成6 組(1%，2%，3%，4% TiF4組，1.356% NaF陽性對照組和DDW陰性對照組，n=10)。

1.3 試件處理

將牙釉質試件浸泡于75 mmol/L乙酸緩沖鹽溶液中(內含8.7 mmol/L CaCl2,8.7 mmol/L KH2PO4，0.05 ppm F，pH=4.0)，37 ℃靜置48 h形成人工早期齲樣白堊色改變[9]。用指甲油封閉開窗區1/2(試件拋光面中間1/3)(圖 1)。

各組分別用1%、2%、3%、4% TiF4溶液，1.356% NaF溶液和DDW處理，將8 μl處理液滴至每個試件的處理區，反應60 s后用DDW沖洗10 s。然后將試件浸泡于再礦化液(1.5 mmol/L CaCl2，0.9 mmol/L KH2PO4，130 mmol/L KCl 和20 mmol/L HEPES，pH=7.0)[10]。試件每天用處理液處理1 次，每天更換新的再礦化液，持續2 周。2 周后，使用丙酮去除指甲油，DDW超聲清洗。用50%、75%、95%和100%乙醇溶液梯度脫水，每個梯度處理10 min。

1.4 Micro-CT檢測

將試件固定在已知密度(1.40 g/cm3)的樹脂棒上，加載于Y.Cheetah micro-CT scanner進行掃描(掃描參數80 kV，35 μA，空間分辨率為5 μm)。用軟件校正以降低射線硬化效應。用VGStudio MAX 2.2軟件將圖像三維重建后，截取剖面，測量脫礦區和處理區的平均深度(圖 2)，計算兩者差值ΔLD=LD1-LD2(LD1:脫礦區的脫礦深度； LD2：處理區的脫礦深度)。

圖 1 試件表面的示意圖

圖 2 Micro-CT三維重建、截取剖面、測量示意圖

Fig 2 Schematic diagram of specimen reconstruction, profile and analysis

1.5 表面顯微硬度測試

采用維氏顯微硬度計，載荷為25 g，保荷時間15 s測定每個試件脫礦區和處理區的表面顯微硬度，方法同前。計算再礦化后與脫礦后的顯微硬度差值ΔSMH=SMH2-SMH1(SMH1 及SMH2 分別為脫礦后和再礦化后表面顯微硬度值)。

1.6 統計學分析

采用SPSS 14.0統計軟件對ΔLD和ΔSMH進行單因素方差分析，檢測水準α=0. 05( 雙側) 。

2 結 果

LSD方法分析ΔLD結果表明，2%TiF4組效果優于3%TiF4組和4%TiF4組，組間具有統計學差異(P<0.05)；2%TiF4組效果優于1%TiF4組、陰性對照組及陽性對照NaF組，但組間無顯著性差異(P>0.05)。

用Dunnett T3方法分析ΔSMH結果表明，2%TiF4組處理后表面硬度與陽性對照NaF組相當(P>0.05)，顯著高于其他組(P<0.05)(表 1)。

綜合micro-CT和SMH結果，可認為2%TiF4溶液對脫礦牙釉質再礦化作用最優。

表 1 實驗各組的ΔLD和ΔSMH數值結果

注： 右上標不同小寫字母： ΔLD組間有顯著性差異(P<0.05)； 右上標不同大寫字母：ΔSMH組間有顯著性差異(P<0.05)

3 討 論

本實驗通過Micro-CT和表面顯微硬度測試2 種方法篩選出了適宜的TiF4溶液濃度，同時發現TiF4溶液對于脫礦牙釉質的再礦化作用并非呈濃度依賴性，不是濃度越高越好。

實驗結果表明，2%TiF4溶液對脫礦牙釉質再礦化作用最優，但是隨著濃度的進一步增加，其再礦化的效果反而降低，4%TiF4溶液組甚至造成進一步的脫礦。這一現象的可能原因在于，TiF4溶液呈酸性，實驗中1%、2%、3%和4% TiF4溶液測得的pH值分別為1.51、 1.28、1.15和1.03，隨著濃度增加，pH值降低。酸性溶液中的H+可以溶解牙釉質中的羥基磷灰石晶體，導致釉質表面脫礦造成表面疏松多孔的結構，從而提高鈣、磷、氟離子進入羥基磷灰石晶體的滲透深度，促進牙釉質的再礦化作用。Hjortsj?等[11]提出，當pH值低于3時，酸性溶液中的游離氟離子會以HF的形式存在，較易滲透進入羥基磷灰石晶體中，形成表層下的CaF2抗酸層，并且CaF2的形成速率在酸性條件下要高于中性條件下的反應速率。Gonzlez-Cabezas等[12]研究表明，在酸性pH時(如pH=3.5)氟處理人牙釉質比在中性pH時氟處理更有效地增加了人牙釉質對氟的攝取，提高了早期齲的表面硬度。本研究中1%、2%和3% TiF4溶液的再礦化機制可能如上所述，而組間的差異可能取決于TiF4的濃度和溶液的pH值。但是當pH值過低時，溶液中氫離子造成牙釉質脫礦、溶解增加，遠遠強于其中氟離子的抑制脫礦和促進再礦化的作用，因此，4% TiF4溶液表現出進一步脫礦的作用。

再礦化的過程是鈣、磷離子沉積到脫礦區牙體硬組織剩余的羥基磷灰石位點的過程[13]。釉質中這種羥基磷灰石晶體的外延性生長形成了再礦化層[14]。通過X線透射可以直接檢測到礦物質沉積帶來的密度的改變，因此，橫斷顯微放射照相術(transverse microradiography, TMR)成為公認的檢測再礦化的金標準。而本研究采用的micro-CT方法與TMR相比，最大的優勢在于不需要制作試件的薄切片，是一種無損的檢測手段，該檢測手段具有良好的前景[15]。

表面顯微硬度測試是一種簡單易行的檢測再礦化的方法，通過壓頭產生的壓痕大小計算出表面的硬度，從而間接反映出礦物質的密度。實驗中形成人工早期齲損后表面的顯微硬度下降，如果壓頭進入試件深度超出齲損的脫礦深度，可能會受到下方健康釉質的不當影響，測得的SMH值不能反映真實情況。本實驗為了避免出現這種錯誤，在測量正常釉質時采用載荷為50 g，而在脫礦和處理后則采用了載荷為更小的25 g。

很多實驗中在試件再礦化處理的間隔都引入了酸蝕脫礦的步驟，進行若干個pH循環，以模擬人體口腔環境的變化[9,16-17]。但是本實驗中在再礦化階段并未加入酸蝕脫礦的步驟，這是因為本實驗的目的是研究TiF4溶液對脫礦牙釉質的再礦化作用這單一方面，避免酸蝕時TiF4對牙釉質的抑制脫礦作用對于最終結果的影響。

綜上所述，2%TiF4溶液對脫礦牙釉質再礦化作用最優，而4%TiF4溶液反而會引起釉質的進一步脫礦。