利用肝臟指數(shù)鑒別人工飼養(yǎng)和野生王錦蛇的研究

林煜田靜茹崔杰李力徐艷春楊淑慧

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，哈爾濱，150040；2.湖南省野生動物救護(hù)繁育中心，長沙，410000；3.國家林業(yè)局野生動物保護(hù)與利用工程技術(shù)研究中心，哈爾濱，150040)

蛇類具有很高的經(jīng)濟(jì)價值，廣泛應(yīng)用于美食、傳統(tǒng)醫(yī)藥、服裝、工藝品加工等行業(yè)。如今，由于過度利用、棲息地喪失、人類干擾等多種原因，野生蛇類的生存一直受到威脅[1]，種群數(shù)量大幅度減少，很多物種已無法作為資源使用。為此，我國的林業(yè)部門推行了一系列保護(hù)政策，防止野生蛇類被過度利用[2]。但因?yàn)閭鹘y(tǒng)文化和傳統(tǒng)醫(yī)藥等原因，人們對蛇類的利用無法停止，我國從2006年展開了蛇類人工馴養(yǎng)繁殖技術(shù)試點(diǎn)工作，推動蛇類人工養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3]，希望以養(yǎng)殖蛇類替代野外資源。目前，我國南方許多省份的養(yǎng)蛇業(yè)已經(jīng)頗具規(guī)模，很大程度上緩解了野生種群的開發(fā)壓力。但是新的問題也隨之出現(xiàn)：隨著蛇類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的不斷擴(kuò)大，蛇類及其產(chǎn)品的相關(guān)貿(mào)易市場被放大，在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，一些投機(jī)分子將野外盜捕的蛇類假借人工飼養(yǎng)的名義進(jìn)行販賣[4]。如果無法正確區(qū)分野生蛇和人工飼養(yǎng)的蛇，執(zhí)法者就無法甄別違法犯罪行為，盜獵的蛇類就會在合法養(yǎng)殖業(yè)中被洗白，從而使養(yǎng)殖業(yè)成為盜獵活動的保護(hù)傘[5-7]。所以，鑒別蛇類來源于養(yǎng)殖場還是野外是保護(hù)野生資源的關(guān)鍵。

目前鑒別野生和人工飼養(yǎng)動物的方法主要包括穩(wěn)定同位素比例[8-10]、脂肪酸譜[11]、金屬元素含量[12]、骨密度[13-14]、骨骼形態(tài)[15-16]以及DNA遺傳標(biāo)記等[17-18]，但可用于蛇類鑒別的方法則十分有限，只有世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)在2015年針對瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約(CITES)附錄中的蛇類提出了一些區(qū)分方法，如野生蛇對飼養(yǎng)條件適應(yīng)性差引起的綜合癥狀、對飼養(yǎng)蛇類體表的理化標(biāo)記或印記、微芯片標(biāo)記、卵殼長寬比的差異、人工選育產(chǎn)生的特殊斑紋、野蛇常有的腸道寄生蟲、DNA標(biāo)記以及C穩(wěn)定同位素相對含量等[19]。但是除了穩(wěn)定同位素比例以外，其他的方法都具有非常特定的適用條件，不能作為通用方法[20]。尤其是在執(zhí)法過程中，蛇類往往不完整，不具有這些特殊的印記、標(biāo)記等線索，這些方法就無法應(yīng)用。因此，亟待建立具有通用性的來源鑒別方法。

在比較野生蛇類和人工飼養(yǎng)蛇類的差異時發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖蛇類的飼料都是營養(yǎng)水平較高的配合飼料[21]，飼料的營養(yǎng)素配比會影響脂肪代謝。養(yǎng)殖過程中飼料足量供應(yīng)[22-23]，但養(yǎng)殖空間狹小，運(yùn)動量少，因而，蛇類在飼養(yǎng)條件下容易積累脂肪[24，25]。身體脂肪的積累伴隨著肝臟中脂肪大量沉積[26]和肝臟體積增大。相比而言，野生蛇類活動空間大，因搜尋獵物、捕食、逃避天敵、尋找或競爭配偶等，運(yùn)動強(qiáng)度相對高，但是食物來源不穩(wěn)定，有時甚至處于饑餓狀態(tài)，所以相對于人工飼養(yǎng)的蛇類的肝臟脂肪沉積量低。

鑒于野生和人工飼養(yǎng)蛇類在肝臟脂肪沉積量和肝臟大小上存在明顯的差異，可以此為基礎(chǔ)，建立鑒別指標(biāo)。為了檢驗(yàn)這一推測，我們選擇在中國廣泛飼養(yǎng)和利用的王錦蛇(Elaphecarinata)作為研究對象，以肝臟大小為基礎(chǔ)，建立兩個具有來源鑒別意義的指標(biāo)，并進(jìn)行了鑒別效果的評價。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與測量方法

從湖南省的養(yǎng)蛇場隨機(jī)采集27條人工飼養(yǎng)的王錦蛇，其中雌性16條，雄性11條，年齡在1.5～2歲之間。另從該省盜獵案件中收繳的野生王錦蛇32條，其中雌性26條，雄性6條，根據(jù)體型判斷為成年蛇。

根據(jù)動物福利原則，將蛇用乙醚深度麻醉致死[27]。按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定體長(Ls-v)、頭長(Lh)、頭高(Hh)、下頜寬(Wm)、鼻間距(Si)[28]，Ls-v精確到0.1 cm，其余量度精確到0.1 mm。將蛇腹部剖開，取出肝臟和腹腔中的脂肪，用電子天平稱量肝臟質(zhì)量(Ml)和腹腔脂肪質(zhì)量(Maf)，均精確到0.1 g。

1.2 數(shù)據(jù)分析

1.2.1 各量度間關(guān)系的分析

用鼻間距Si、下頜寬Wm、頭長Lh和頭高Hh所構(gòu)成的立方體來估算頭部體積(Vh)，如圖1所示，計算公式如下：

蛇的身體可以粗略地看作圓柱體，身體體積(Vb)用頭高(Hh)作為直徑，以體長(Ls-v)為長度來估算，計算公式如下：

采用線性回歸方法分析Vh和Vb的關(guān)系、Ml與Maf的關(guān)系、Ml與Vh的關(guān)系，以及Ml與Vb的關(guān)系，分別得出相應(yīng)的線性回歸方程y=ax+b。

圖1 王錦蛇頭部體積參數(shù)示意圖Fig.1 Diagram of measurements for estimation ofhead volume of the king rat snake

1.2.2 蛇來源鑒別指標(biāo)的構(gòu)建

以肝臟質(zhì)量(Ml)分別與頭部體積(Vh)和身體體積(Vb)構(gòu)建兩個比值，分別稱為肝-頭指數(shù)(Ilh)和肝-體指數(shù)(Ilb)，意義是肝臟相對于頭部體積和身體體積的密度，其單位定義為g/cm3。如果Ilh和Ilb在野生個體與人工飼養(yǎng)個體之間存在顯著差異，就可以用這兩個指標(biāo)來鑒別王錦蛇的來源。

先用Kolmogorov-Smirnov Test檢驗(yàn)野生組和飼養(yǎng)組的各項(xiàng)量度和計算值是否符合正態(tài)分布(α=0.05)，符合正態(tài)分布后直接進(jìn)行組間的均值比較，否則進(jìn)行正態(tài)化轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行均值比較。Ilh和Ilb的組間均值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，顯著水平為α=0.05。若指標(biāo)在組間存在顯著差異(α=0.05)，則采用Fisher判別計算其對已知來源樣品的正確回判率，用以評估該指標(biāo)在野生和人工飼養(yǎng)王錦蛇的判別能力。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均使用SPSS 19.0軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 各項(xiàng)量度的描述性統(tǒng)計

野生組和飼養(yǎng)組王錦蛇的Ls-v、Lh、Hh、Wm、Si、Ml、Maf等各項(xiàng)量度和Vh、Vb兩個計算值的統(tǒng)計結(jié)果如表1。經(jīng)K-S檢驗(yàn)，各項(xiàng)量度和計算值在野生組和飼養(yǎng)組都符合正態(tài)分布(P=0.209～0.982)，故此，可直接進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)來比較均值。結(jié)果顯示，Ls-v、Lh、Hh、Wm、Si、Vh、Vb野生組顯著大于飼養(yǎng)組(0.000

表1 野生組和飼養(yǎng)組王錦蛇的各項(xiàng)量度的均值差異顯著性檢驗(yàn)(均值±SD)

Tab.1 Comparisons of measurements between wild and farmed king rat snakes(mean±SD)

2.2 各項(xiàng)量度間的關(guān)系

采用線性回歸方法分析Vh和Vb的關(guān)系、Ml與Vh的關(guān)系，Ml與Vb的關(guān)系以及Ml與Maf的關(guān)系，得出線性回歸方程y=ax+b。如果肝臟質(zhì)量與腹腔脂肪積累量存在明確的正相關(guān)，那么，肝臟質(zhì)量就可以體現(xiàn)野生組和飼養(yǎng)組能量攝入和支出差異的可靠指標(biāo)，進(jìn)而以其為基礎(chǔ)建立來源鑒別指標(biāo)。將Ml與Waf做線性回歸分析顯示，二者在飼養(yǎng)組和野生組均呈極顯著的正相關(guān)(飼養(yǎng)組R2=0.779，野生組R2=0.366；P值均為0.000)，而飼養(yǎng)組Ml隨Waf的變化速度高于野生組(野生組a=0.153，飼養(yǎng)組a=0.284，如圖2A)。這一趨勢顯示，肝臟質(zhì)量在一定程度上顯示出動物營養(yǎng)狀況的差異，飼養(yǎng)組的營養(yǎng)狀況好于野生組，而肝臟質(zhì)量也隨之加大，并隨著營養(yǎng)狀況的提高，肝臟質(zhì)量提高迅速。

結(jié)果顯示，無論是野生組還是飼養(yǎng)組，Vh和Vb之間均存在著顯著正相關(guān)關(guān)系(野生組R2=0.781，飼養(yǎng)組R2=0.668，P值均為0.000)，而且兩組間的關(guān)系非常相似(圖2B)，這說明王錦蛇頭部的大小和身體體積大小相關(guān)性很高，因此，無論在野生組和飼養(yǎng)組，頭部體積都可作為體型大小的忠實(shí)指標(biāo)。這樣，肝-頭指數(shù)就和肝-體指數(shù)一樣，能夠有效消除個體大小對肝臟質(zhì)量比較的影響。

將Ml分別與Vh和Vb做線性回歸分析，結(jié)果顯示，野生組和飼養(yǎng)組的Ml均與Vh呈顯著正相關(guān)(野生組R2=0.348，飼養(yǎng)組R2=0.369；P值均為0.001)，但兩組的變化趨勢不同，飼養(yǎng)組的Ml隨Vh增加的速度高于野生組(飼養(yǎng)組a=5.115，野生組a=1.957)，但是兩組的截距相差不大(飼養(yǎng)組b=-11.245，野生組b=-2.767，如圖2C)。Ml和Vb的線性回歸也顯示出顯著正相關(guān)的趨勢(野生組R2=0.367，P=0.001；飼養(yǎng)組R2=0.293；P=0.004)，并且飼養(yǎng)組的Ml隨Vb增加的速度也高于野生組(飼養(yǎng)組a=0.169，野生組a=0.068)，同樣截距的組間差異較小(飼養(yǎng)組b=1.567，野生組b=1.308，圖2D)。這一趨勢表明，蛇的Vh和Vb較小時，Ml對野生組和飼養(yǎng)組的區(qū)分能力十分有限，但在當(dāng)Vh和Vb較大時，其區(qū)分能力越來越大。

2.3 Ilh和Ilb的組間差異和性別差異

野生組中，肝-頭指數(shù)Ilh為(1.789±0.533)g/cm3；飼養(yǎng)組中，Ilh為(4.043±1.582)g/cm3。K-S檢驗(yàn)顯示，Ilh在野生組和飼養(yǎng)組中均符合正態(tài)分布(P>0.05)。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)顯示，飼養(yǎng)組的Ilh極顯著大于野生組(|t|=7.073，P=0.000)。野生組的肝-體指數(shù)Ilb為(0.072±0.023)g/cm3；飼養(yǎng)組的Ilb為(0.177±0.072)g/cm3，飼養(yǎng)組亦極顯著高于野生組(|t|=7.285，P=0.000)。

此外，Ilh和Ilb在野生組和飼養(yǎng)組都存在顯著的性別差異(表2)，雌性極顯著高于雄性(野生組的Ilh：P=0.046，Ilb：P=0.037；飼養(yǎng)組的Ilh：P=0.016；Ilb：P=0.009)。

圖2 野生組和飼養(yǎng)組Ml與Maf(A)、Vh和Vb(B)、Ml與Vh(C)以及Ml與Vb(D)的相關(guān)性的比較Fig.2 Inter=group comparison of correlation between Ml and Maf(A)，Vh and Vb(B)，Ml and Vh(C)，and Ml and Vb(D)● 野生組；○ 飼養(yǎng)組● Wild group；○ Farm group

表2 野生組和飼養(yǎng)組的Ilh和Ilb在性別差異性比較

Tab.2 Comparison of inter-sex differences of index Ilh and Ilb between wild and farm groups

2.4 Ilh和Ilb對來源的判別力

當(dāng)不考慮性別差異時，直接檢驗(yàn)兩組樣本Ilh和Ilb的正確回判率(%)，Ilh和Ilb指標(biāo)在野生組判別正確率均為96.9%，飼養(yǎng)組為74.1%，整體為86.4%。雖然如此，因?yàn)閮蓚€指標(biāo)均存在顯著的性別差異，野生組的雌性與飼養(yǎng)組的雄性之間數(shù)據(jù)重疊度比較大，進(jìn)行來源回判時，Ilh和Ilb在野生組雌性正確判別率均為96.2%，飼養(yǎng)組雄性均為63.6%，整體正確判別率均達(dá)到86.5%，可見野生組雄性的錯判風(fēng)險很高(表3)。如果性別已知，對同一性別之間進(jìn)行判別，對于雄性來說，Ilh和Ilb對野生組的正確判別率均達(dá)到100%，飼養(yǎng)組均達(dá)90.9%，整體均為94.1%。對兩組的雌性進(jìn)行判別時，Ilh對于野生組正確判別率達(dá)到100%，飼養(yǎng)組為81.3%，整體為92.9%；Ilb對于野生組正確判別率達(dá)到96.2%，飼養(yǎng)組為81.3%，整體為90.5%。可見性別已知時的判別率大大提高。

表3 Ilh和Ilb指標(biāo)對王錦蛇來源的判別力(正確回判率%)

Tab.3 Power of origin assignment(correctness，%)of Ilh and Ilb in the king rat snake

3 討論

爬行類在營養(yǎng)過剩和運(yùn)動量不足時，會導(dǎo)致肝臟中脂肪過渡沉積，從而使肝臟質(zhì)量增加[29-30]。我們觀察發(fā)現(xiàn)，如果飼養(yǎng)條件下，蛇類的營養(yǎng)供應(yīng)充分，而又始終生活在狹小的籠舍內(nèi)，運(yùn)動量很小，其肝臟質(zhì)量有增加的趨勢。本研究顯示，在消除體型大小影響后，比較野生組和飼養(yǎng)組肝臟質(zhì)量時，飼養(yǎng)組極顯著高于野生組，印證了我們的推測。

近些年，蛇類養(yǎng)殖逐漸實(shí)現(xiàn)了規(guī)模化、集約化和標(biāo)準(zhǔn)化[31]，養(yǎng)蛇技術(shù)的發(fā)展方向始終在于追求較高的飼料報酬，而開發(fā)營養(yǎng)平衡飼料和充分飼料供應(yīng)都是提高飼料報酬的核心措施。因此，人工飼養(yǎng)的蛇類營養(yǎng)狀況始終會高于野生蛇類，這就為采用肝臟質(zhì)量來鑒別蛇類的來源提供了穩(wěn)定的環(huán)境基礎(chǔ)。

采用肝-頭指數(shù)和肝-體指數(shù)可以消除體型大小的影響。Fisher’s判別分析顯示，在野生組和飼養(yǎng)組，Ilh可將96.9%的野生組個體正確回判，將74.1%的飼養(yǎng)組個體正確回判，整體正確率為86.4%。Ilb的正確回判率在野生組為96.9%，飼養(yǎng)組為74.1%，整體為86.4%。這說明整體上講，這兩個指標(biāo)是比較有效的來源鑒別指標(biāo)。

影響正確回判率的因素除了個體間差異以外，就是兩個指標(biāo)在性別間的差異，不僅飼養(yǎng)組顯著高于野生組，而且雌性高于雄性(表2)。這樣一來，野生組的雌性與飼養(yǎng)組的雄性的數(shù)值就比較接近，從而導(dǎo)致判別錯誤。將野生組雌性和飼養(yǎng)組雄性進(jìn)行比較判別時，Ilh和Ilh僅能把63.6%的飼養(yǎng)組雄性個體正確回判，錯判風(fēng)險高達(dá)36.4%(表3)。

在這種情況下，實(shí)際鑒定中需要按照性別分別構(gòu)建參考數(shù)據(jù)，將兩組的同一性別進(jìn)行比較和判別，從而提高判別的正確率。譬如，本研究中，對雄性進(jìn)行判別時，Ilh對野生組的正確回判率為100%，飼養(yǎng)組為90.4%，整體達(dá)到94.1%。該指標(biāo)對雌性判別時，野生組的正確回判率亦為100%，飼養(yǎng)組的為81.3%，整體仍達(dá)到92.9%。Ilb的情形與Ilh一致，同一性別的正確判別率高達(dá)90.5%(雌性)和94.1%(雄性)。

Ilb和Ilh的必要量度是肝臟質(zhì)量、頭部量度和體長，所以，適合于死亡個體的鑒定。尤其是Ilh只需要肝臟完整和頭部完整即可，這對不完整個體比較便利。但是頭高、下頜寬等有時受標(biāo)本形變的影響而不易測準(zhǔn)，測定時應(yīng)注意把標(biāo)本回復(fù)到自然狀態(tài)下。