滇金絲猴糞便類固醇激素抽提及檢測方法評估

黎嘉欣楊秋立普天春盧雁平王偉劉學鋒劉定震

(1.北京師范大學生命科學學院，教育部生物多樣性與生態工程重點實驗室，北京，100875；2.圈養野生動物技術北京市重點實驗室，北京動物園，北京，100044)

近年來，非損傷取樣法在野生動物激素水平檢測上得到了充分的運用，其中糞便樣品因其采集、保存和運輸便利等優勢而被廣泛使用[1]。正常情況下，糞便中性激素濃度與血液中性激素濃度正相關[2]。然而，由于激素在糞便中的代謝有滯后性，糞便與血液樣品的激素檢測結果會呈現分泌高峰時間不一致的現象[3]，加之對激素的不同抽提和檢測方法，往往導致最終檢測結果迥異。如何選擇合適的激素抽提方法和測定方法，是準確反映動物體內類固醇激素水平的關鍵[4]。

非人靈長類的繁殖行為及結果多由雌性的發情狀況決定，通過監測雌性的性激素水平可以深入了解其繁殖策略。以往在恒河猴(Macacamulatta)[5]、日本獼猴(Macacafuscatafuscaca)[6]、夜猴(Aotustrivirgatus)[7]、黑葉猴(Trachypithecusfrancoisi)[8]、滇金絲猴(Rhinopithecusbieti)[9]等多數非人靈長類中均有較好的應用。雌二醇(estradiol，E2)或孕酮(progesterone，P4)分泌水平的高低基本能反映雌性的繁殖狀態[10-12]。而王慧平等對川金絲猴(Rhinopithecusroxellana)糞尿激素抽提方法比較的結果顯示，不同抽提方法的萃取率存在差異[11]。考慮到不同物種，乃至同一類群的不同種群糞便中激素代謝物的種類均可能不同[4]，且不同激素性質有所差異，所以針對不同種類的靈長類和激素可能需要考慮不同的激素提取和檢測方法。

滇金絲猴隸屬于靈長目(Primates)猴科(Cercopithecidae)疣猴亞科(Colobinae)仰鼻猴屬(Rhinopithecus)，是我國特有的珍稀靈長類動物。目前野生種群數量約為2500只，棲息地破碎化和喪失比較嚴重[13]。圈養種群總數為29只，主要飼養于北京動物園、昆明動物園和昆明動物研究所。以往對滇金絲猴種群的地理分布、群體行為、食性等開展了一系列研究[14-15]，但受限于野外工作條件，對該物種的繁殖行為與激素水平的研究較少。借助針對圈養種群繁殖行為與激素水平關系的研究，不僅可為圈養滇金絲猴的遷地保護提供理論支持，同時為進一步對野生種群的研究奠定基礎。為此，本文分別采用3種抽提方法與2種檢測方法，對圈養雌性滇金絲猴糞樣中E2及P4含量進行了檢測，并比較了不同方法組合的激素相對含量、相對誤差和變異系數，以期探索適用于滇金絲猴糞便樣品激素檢測的合適方法，為進一步研究野生滇金絲猴的繁殖生理提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗所用21份糞便樣品分別采集于北京動物園昌平十三陵飼養繁育基地的一雄二雌繁殖群中的2只成年雌性滇金絲猴——“芳芳”與“大慶”，以及北京動物園的成年雌性“01-2”，共計3只個體。其中“大慶”的糞便7份、“芳芳”的糞便6份、“01-2”的糞便8份。

1.2 實驗方法

1.2.1 糞便樣品的采集、保存與干燥

實驗人員站在籠舍周圍，觀察目標個體，一旦發現其排便后，將糞便除去雜物后立即裝于自封袋，標記日期、時間和個體名稱，保存于-20℃冰箱，待測。將收集的21份糞便樣品放于-70℃冰箱冷凍過夜，記錄糞便重量41.13 g。-55℃真空冷凍干燥機中干燥約9 h，記錄凍干糞便重量13.72 g(含水量為66.64%)，將糞便樣品研磨成粉末狀并篩除雜質。所有糞便樣品放入同一離心管中，置于渦旋儀上振蕩至混合均勻，以排除不同個體、不同采集時間等因素對檢測結果可能造成的影響。

1.2.2 激素提取

根據王慧平等[11]對于川金絲猴的糞便類固醇激素抽提方法的評估，并參考其他非人靈長類動物糞便激素提取中常用抽提方法和改良途徑，采用以下3種抽提方法進行激素的提取。

乙醇加熱法(ethanol-heating method，EH)：參照Wasser等[10]的步驟，應用80%乙醇對0.1 g混合糞樣進行抽提，其中煮沸改為70℃水浴20 min，離心條件由室溫改為4℃，并合并2次上清液，將其置于60℃條件下氮氣吹干后加入1 mL 0.05 mol/L的PBS溶解，離心后將上清轉移至2 mL的離心管待測。

乙醇-蒸餾水法(ethanol-distilled-water method，EW)：參照高云芳等[16]的步驟，首先應用5 mL 80%乙醇對0.1 g混合糞樣進行抽提，其中超聲波振蕩改為渦旋振蕩，并將37℃水浴干燥步驟改為37℃氮氣吹掃儀干燥。在加入1 mL 0.05 mol/L的PBS溶解后，37℃水浴振蕩30 min，離心后將上清轉移至2 mL離心管待測。

乙醇-丙酮法(ethanol-acetone method，EA)：參照Heistermann等[17]的步驟，首先應用4 mL無水乙醇和1 mL無水丙酮對0.1 g混合糞樣進行抽提，離心條件由室溫改為4℃，60℃條件下氮氣吹掃，之后加入0.05 mol/L的PBS溶液復溶，離心后將上清轉移至2 mL的離心管待測。

分別以上述3種方法對糞樣中的雌二醇和孕酮進行抽提，各重復6次。同時對每種抽提方法各設置1個空白對照組，即不加入糞樣，完成全部抽提步驟并保存所得溶液，與上述樣品進行同一批次的激素檢測，以排除抽提步驟所用試劑對檢測試劑盒中抗體與激素的反應可能造成的影響。

1.2.3 糞便激素水平檢測

將上述激素抽提樣品，每份各取500 μL于2 mL離心管中留作P4的RIA法和ELISA法檢測。對于乙醇加熱法以及乙醇蒸餾水法，將樣品分別稀釋48倍和64倍留作E2的ELISA法的檢測，均稀釋80倍的樣品留作E2的RIA法的檢測；對于乙醇丙酮法，將樣品稀釋8倍留作E2的檢測，確保其檢測結果處于相應試劑盒的允許檢測范圍之內，將稀釋后的樣品存于-20℃冰箱。激素檢測委托北京北方生物研究所完成。每份樣品平行測試3次。所用檢測試劑盒分別為碘[125I]雌二醇和碘[125I]孕酮放射免疫分析試劑盒、雌二醇和孕酮定量測定酶聯免疫試劑盒(北方生物研究所，北京)。有關試劑盒的詳細參數詳見說明書。

1.3 數據分析

首先，采用Kolmogorov-Smironov test檢驗數據是否符合正態分布，然后以檢測方法作為組間因子，抽提方法作為組內連續檢測變量對數據進行重復測量的雙因素方差分析(repeated measure two-way ANOVA)，隨后，對具有顯著差異的組合分別進行配對t-檢驗(paired-samplettest)，分析抽提方法與檢測方法對檢測結果的影響。

由于2個檢測方法對同一類固醇性激素的靈敏程度和每個抽提方法對空白對照組的反應程度不同，不能直接對2種方法空白對照組的平均檢測含量進行比較，所以使用相對誤差描述空白對照組檢測結果對抽提及檢測方法組合檢測結果的影響。其計算公式為：相對誤差=空白對照組平均檢測含量/實驗組平均檢測含量×100%。結合平均激素含量與相對誤差，比較得出提取效率較高且受空白對照影響較小的抽提與檢測方法組合。

根據公式CV%=(SD/Mean)×100%計算每個組合的變異系數，對比獲得穩定性較高的抽提及檢測方法組合。

所有統計檢驗通過SPSS 20.0(IBM Corporation，NY，USA)完成。借助OriginPro 8.0繪圖。顯著水平為0.05，P<0.01為差異極顯著。數據用Mean±SD表示。

2 結果與分析

2.1 不同抽提方法與檢測方法對糞便中類固醇性激素檢測結果影響的比較

以抽提方法為組內因子，以檢測方法為組間因子對糞便中孕酮含量檢測結果進行two-way ANOVA分析，結果表明，使用不同抽提方法與不同檢測方法檢測，結果均有極顯著差異(P均為0.0001)，且抽提方法與檢測方法之間有交互作用。進一步多重比較分析結果表明，對于RIA與ELISA兩種檢測方法，乙醇加熱法與乙醇-蒸餾水法之間均沒有顯著差異，而乙醇-丙酮法的檢測結果顯著低于另外兩種抽提方法的檢測結果(圖1)。

以抽提方法為組內因子，以檢測方法為組間因子對糞便中雌二醇含量檢測結果進行repeat measure two-way ANOVA分析，結果表明，RIA與ELISA兩種檢測方法對測定結果有極顯著影響(P=0.0001)；乙醇加熱法與乙醇蒸餾水法2種抽提方法的測定結果間無明顯差異(P=0.584)；抽提方法與檢測方法之間無交互作用(圖2)。對于乙醇加熱法，RIA結果顯著低于ELISA的檢測結果；而對乙醇-蒸餾水法，兩種檢測方法的結果無明顯差異(圖2)。

2.2 比較不同抽提及檢測方法的組合間糞便類固醇激素的平均激素含量、相對誤差及變異系數的差異

對混合糞樣中的孕酮而言，乙醇-丙酮法的激素含量測定結果明顯偏低，乙醇加熱法與乙醇-蒸餾水法無明顯差異；對于混合糞樣中的雌二醇而言，乙醇-蒸餾水法的激素含量測定結果較高，提取效率較高(表1)。

圖1 不同抽提方法與檢測方法對應的糞便中孕酮的檢測結果(柱圖表示Mean±SD)。本研究對數據使用two-way ANOVA進行分析，并對具有顯著差異的組合進行了paired-sample t test，對有顯著差異的數據使用不同上標或是橫線連接后以星號標注Fig.1 Mean content of progesterone(P4)in mixed fecal sample under different extraction and test methods.Bars with different letters，either capital or small letters in the same assay method，indicate significant differences(repeated measure two-way ANOVA followed by post hoc test of paired-sample t test)

圖2 不同抽提方法與檢測方法對應的糞便中雌二醇的檢測結果(柱圖表示Mean±SD)。本研究對數據使用two-way ANOVA進行分析，并對具有顯著差異的組合進行了paired-sample t test，對有顯著差異的數據使用不同上標或是橫線連接后以星號標注Fig.2 Mean content of estradiol(E2)in mixed fecal sample under different extraction and test methods.Bars with different letters，either capital or small letters in the same assay method，indicate significant differences(repeated measure two-way ANOVA followed by post hoc test of paired-sample t test)

表1 不同抽提與檢測方法的混合糞樣激素含量測定結果(Mean±SD)

Tab.1 Fecal concentrations of progesterone and estradiol using different extracting and testing methods

相對誤差的大小能夠在一定程度上表明測定結果的準確度，相對誤差小則檢測方法的準確度高。對于孕酮而言檢測準確度較高的組合有二：RIA與乙醇加熱法的組合以及ELISA與乙醇-丙酮法的組合；對于雌二醇而言檢測準確度有明顯優勢的是RIA，其中乙醇加熱法的空白對照組未檢測出激素含量(表2)。

表2 不同抽提與檢測方法的空白對照激素含量測定結果(Mean±SD)及混合糞樣的相對誤差

Tab.2 Fecal concentrations of progesterone and estradiol in negative control(Mean±SD)and relative errors using different extracting and testing methods

注：相對誤差=空白對照組平均檢測含量/實驗組平均檢測含量×100%

Note：Relative error=content of negative control/content of fecal sample×100%

變異系數的大小能夠表征檢測的穩定性，變異系數小則方法組合的穩定性高。孕酮檢測結果變異系數較小的組合為RIA與乙醇加熱法；對于雌二醇而言，乙醇加熱法的變異系數明顯小于乙醇-蒸餾水法，其中與RIA的組合變異系數最小(表3)。

表3 不同抽提方法與檢測方法組合檢測結果的變異系數

Tab.3 Coefficient variation of fecal progesterone and estradiol level using different extracting and testing methods

注：變異系數CV%=(SD/Mean)×100%

Note：CV%=(SD/Mean)×100%

3 討論

本研究結果表明，不同的激素抽提和檢測方法對滇金絲猴糞便中孕酮和雌二醇的檢測結果都有顯著影響。對于孕酮，乙醇-丙酮法提取效率明顯偏低，乙醇加熱法與乙醇-蒸餾水法在提取效率上無明顯差異，但乙醇加熱法與RIA法組合檢測結果的準確性較高；同時乙醇加熱法與RIA的組合變異系數明顯較小，穩定性較高，因此可認為乙醇加熱法與RIA的組合有較明顯的優勢。本研究中乙醇丙酮法提取效率偏低的結果，與以往針對黃狒狒(Papiocynocephalus)、絹毛猴(Callithrixjacchus)、鞍背狨(Saguinusfuscicollis)、棉頂狨(Saguinusoedipus)和川金絲猴雌性個體糞樣中孕酮回收率較高(>80%)的結果[11，17-18]不同。這表明種屬差異可能是影響不同抽提及檢測方法組合的抽提率和穩定性的因素之一。對于雌二醇，乙醇-蒸餾水法提取效率較高，但乙醇-蒸餾水法穩定性明顯偏低且步驟繁瑣，不利于針對野外大批量的糞樣處理操作。乙醇加熱法中，RIA與ELISA兩個檢測方法的穩定性表現差異不大，但由于ELISA測定的雌二醇含量相對誤差較大，綜合考慮認為乙醇加熱法與RIA的組合較有優勢。

乙醇加熱法與RIA的組合對于雌二醇與孕酮均為較理想的抽提檢測方法組合。乙醇加熱法是經典、簡便的激素抽提方法，在多個物種的糞樣激素抽提中均有較理想的應用[10-11，19-20]。3種抽提方法在抽提激素的過程中均涉及干燥步驟，常用方法有恒溫水浴和氮氣吹掃。由于水浴蒸干耗時極長，本實驗將干燥條件統一改為氮氣吹干，并保留原方法中要求的水浴溫度，以加快抽提速度，但相應的抽提成本有所增加。RIA是最早用于激素檢測的免疫檢測法，在1969年已有人用于檢測血清中E2的含量。該法靈敏度較ELISA高且結果穩定，但要求必須在具備資質的同位素實驗室操作，具有對實驗室防護條件要求高、試劑存放周期短等缺點。若實驗室條件允許，建議選用RIA進行激素水平檢測。

綜上所述，建議在實驗條件允許的情況下，采取氮氣吹干法改良的乙醇加熱法提取激素，以RIA法檢測滇金絲猴糞便中雌二醇與孕酮含量。同時，建議以類固醇激素水平監測其他靈長類動物的繁殖行為時，最好綜合本文提及的3種參數比較方法，首先對激素抽提法進行篩選，然后再進行后續的檢測。

致謝：感謝北京動物園的飼養員幫助采集金絲猴糞便樣品，西北大學生命科學學院王慧平提供參考文獻，北京師范大學生命科學學院佟麗借用冷凍干燥機、碩士研究生唐如春、博士研究生劉若爽與范鵬來等提供技術指導，謹此表示誠摯的謝意！