制備RGDS/rt-PA雙負載靶向微泡并初步評價其靶向性溶栓效果

王曉妤，穆玉明，麥培培，史 琪，狄 敏，黃偉良，關麗娜

(新疆醫科大學第一附屬醫院心臟超聲診斷科，新疆 烏魯木齊 830011)

超聲聯合靶向微泡和藥物溶栓治療是目前的研究熱點，其中將靶向配體或溶栓藥物與微泡進行單負載結合的研究[1-3]較多，而將靶向配體和藥物同時與微泡結合，從而制備具有血栓靶向且攜帶藥物的雙負載靶向超聲微泡者較少。本研究擬應用生物素—親和素系統(biotin-avidin system, BAS)橋接法將血栓靶向配體[精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸片段(Arg-Gly-Asp-Ser segments, RGDS)]及重組織纖溶酶原激活物(rt-PA)與超聲微泡進行連接，制備RGDS/rt-PA雙負載靶向微泡，分析其物理特性、藥物負載量、聲學顯像特征及其對富血小板血栓(platelet-rich thrombus, PRT)的靶向性和溶栓作用。

1 材料與方法

1.1 制備微泡造影劑

1.1.1 制備RGDS、rt-PA單負載微泡 對rt-PA(BOC Sciences)和RGDS(上海子起生物科技有限公司特約合成)進行生物素化(Thermo)及熒光標記，以異硫氰酸熒光素(FITC)標記rt-PA，產物呈黃綠色熒光；以5-羧基四甲基羅丹明(5-TAMRA)標記RGDS，產物呈橙紅色熒光。將RGDS及rt-PA分為5個劑量單位(1.25、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg)，分別與200 μl Targestar-SA超聲微泡(Targesom)混勻，避光常溫孵育0.5 h后，采用浮選法重復洗滌2次[4]。然后對配制好的標本進行理化性質等檢測壓片，置于熒光正置顯微鏡(Olympus BX53)下觀察標記情況，以流式細胞儀(BD)檢測表達熒光微泡占總微泡的比例，分析微泡與配體的結合率，獲得單負載微泡的最佳結合劑量。

1.1.2 制備RGDS/rt-PA雙負載靶向微泡 將RGDS及rt-PA以單負載最佳結合劑量連接在微泡上，制成雙負載微泡，配體加入順序分為3種：①先加RGDS，再加rt-PA；②先加rt-PA，再加RGDS；③將RGDS及rt-PA混勻后加入。洗滌后分別置于熒光顯微鏡下觀察，并計算加入順序不同配體與微泡的雙負載結合率。

1.2 檢測微泡的物理特性 分別取裸微泡、單負載及雙負載微泡的少量混懸液靜置后觀察外觀。采用Multisizer 4e顆粒分析儀(Beckman Coulter)測定粒徑及濃度，并以精密pH計測定pH值。采用光學顯微鏡觀察不同微泡的形態、結構、大小及分布情況。將RGDS/rt-PA雙負載靶向微泡(50 μl)滴于載玻片上，涂抹均勻，自然風干后進行噴金處理，以掃描電鏡(加速電壓10 kV、工作距離9.5 mm；JEOL JSM-6390LV)觀察圖像，并以熒光顯微鏡(激發波長490、529 nm)觀察雙負載靶向微泡中RGDS及rt-PA熒光標記情況。

1.3 測定藥物負載量 將RGDS/rt-PA雙負載靶向微泡200 μl置于3 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中漂洗，采用低溫離心機(Thermo)以1 500 r/min，離心3 min，取20 μl上層微泡，經超聲裂解去除微泡(輻照條件：超聲頻率1.5 MHz、發射功率2 W、輻照時間15 s)作為待測樣品，應用BAC蛋白濃度測定試劑盒(Biosharp)測定樣品中rt-PA的含量[5]。

1.4 制備PRT血栓 抽取10名健康獻血者(1周內無用藥史)的靜脈血，每名8～10 ml，以低溫離心機在180 G重力作用下離心10 min。取3.5 ml上清液及0.5 ml富含血小板的邊界層，混勻后注入EP管中。依次加入腺苷二磷酸(ADP，80 μmol/L)、氯化鈣(CaCl2，80 mmol/L)、凝血酶(0.5 IU/ml)后，置于37.8℃恒溫箱中孵育40 min[6]。本研究經我院倫理委員會批準，所有獻血者均知情同意。

1.5 聲學顯像特征及溶栓能力 以注入PBS及PRT血栓的醫用硅膠管為血管血栓模型。采用Philips iE33超聲診斷儀，S5-1探頭，頻率2 MHz，機械指數1.0，以間歇輻照模式(輻照5 s，間歇10 s)作用 30 min。注入200 μl RGDS/rt-PA雙負載靶向微泡，觀察其超聲成像效果；超聲輻照30 min后以PBS液沖管處理，繼續觀察溶栓后血栓的聲像圖特征。以掃描電鏡觀察血栓標本結構變化，并制作冰凍切片，以熒光顯微鏡(激發波長490、529 nm)觀察血栓內部RGDS與rt-PA的熒光標記情況。

表1 不同微泡間物理特性比較(±s)

表1 不同微泡間物理特性比較(±s)

微泡類型直徑(μm)濃度(×109/ml)pH值裸微泡2.37±0.022.70±0.016.55±0.01RGDS單負載靶向微泡2.38±0.052.72±0.026.77±0.03rt-PA單負載靶向微泡2.27±0.032.69±0.016.63±0.02RGDS/rt-PA雙負載靶向微泡2.32±0.032.71±0.016.27±0.03F值1.2630.4210.982P值0.2710.6470.472

表2 不同劑量梯度的配體與微泡的單負載結合率比較(±s)

表2 不同劑量梯度的配體與微泡的單負載結合率比較(±s)

劑量(mg)RGDS(%)rt-PA(%)F值P值0.031 2584.33±0.6876.06±1.8254.1410.0020.062 592.33±1.47*82.36±1.82*70.2560.0010.12587.30±1.37*#76.06±1.42*#72.6140.0010.2586.86±3.53*#△74.32±1.61*#△20.1120.0111.2585.13±3.02*#△▲71.48±2.01*#△▲42.3960.003F值5.53214.478--P值0.0130.001-- 注:*:與同一配體0.031 25 mg相比,P<0.04;#:與同一配體0.062 5 mg相比,P<0.02;△:與同一配體0.125 mg相比,P<0.03;▲:與同一配體0.25 mg相比,P<0.04

1.6 統計學分析 采用SPSS 21.0統計分析軟件。計量資料以±s表示。采用單因素方差分析比較裸微泡、單負載及雙負載微泡的物理特性、不同劑量梯度下同一配體與微泡的單負載結合率、同一劑量梯度下不同配體與微泡的單負載結合率、加入順序不同的配體與微泡的雙負載結合率，兩兩比較采用LSD檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 物理特性 不同微泡外觀均為乳白色微渾液體，靜置后分層，上層為白色微泡，下層為澄清透明液體。光學顯微鏡下裸微泡、單負載靶向微泡及雙負載靶向微泡的形態無明顯區別(圖1A)，均為光整、細小的圓形結構，環形外殼包繞中央半透亮區，大小均勻，無聚集現象。掃描電鏡下RGDS/rt-PA雙負載靶向微泡呈球形結構，略有聚集現象(圖1B)。不同微泡的直徑、

濃度及pH值差異均無統計學意義(P均>0.05，表1)。RGDS/rt-PA雙負載靶向微泡表面可激發出rt-PA及RGDS的指環狀熒光標記，熒光染色均勻(圖1C、1D)。RGDS/rt-PA雙負載靶向微泡(激發波長570 nm處)吸光度平均值為0.188，RGDS/rt-PA微泡中rt-PA相對蛋白濃度為498.52 μg/ml。

2.2 結合率 不同劑量梯度下rt-PA、RGDS與微泡的單負載結合率差異均有統計學意義(P均<0.05)，且同一配體不同劑量間兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。同一劑量梯度下rt-PA與微泡單負載的結合率均低于RGDS(P均<0.05)。RGDS及rt-PA均為0.062 5 mg時，分別與200 μl Targestar-SA超聲微泡的結合率最高(表2)。

圖1 RGDS/rt-PA雙負載靶向微泡 A.光學顯微鏡下微泡呈細小圓形結構，環形外殼包繞中央半透亮區，大小均勻，無聚集現象； B.掃描電鏡下微泡呈球形結構，略有聚集現象； C、D.同一視野熒光顯微鏡下微泡攜rt-PA呈綠色指環狀熒光(C)、攜RGDS呈橙紅色指環狀熒光(D)

圖2 體外血栓模型 A～C.體外血栓模型RGDS/rt-PA雙負載靶向泡注入前(A)、注入后(B)、PBS洗滌沖管后(C)聲像圖; D、E.掃描電鏡示溶栓前(×3 000,D)、后(×3 000,E)的血栓模型結構圖; F、G.熒光顯微鏡下血栓模型內部可見標記RGDS的橙紅色熒光(F)及標記rt-PA的綠色熒光(G)

以單負載最佳結合劑量(0.062 5 mg)將rt-PA及RGDS與微泡結合，加入順序不同的配體與微泡雙負載結合率差異均有統計學意義(F=16.090，P=0.004)，其中RGDS與rt-PA混勻后加入的結合率最高(表3)。

2.3 聲學顯像特征 超聲示血栓模型呈均勻中高回聲，將RGDS/rt-PA雙負載靶向微泡注入管腔后，可見均勻分布的點狀高回聲，血栓邊界回聲明顯增強。經PBS液沖管后，血栓表面仍呈高回聲，但較前明顯減低，內部點狀高回聲分布體積也較前縮小(圖2A～2C)。

2.4 溶栓能力 掃描電鏡下血栓模型呈大量致密的纖維蛋白網狀結構，其內可見活化的血小板及紅細胞(圖2D)；經RGDS/rt-PA雙負載靶向微泡聯合超聲輻照后，纖維蛋白網狀結構明顯破壞、纖維束斷裂成細沙狀，并可見變形融合的血細胞(圖2E)。熒光顯微鏡下血栓模型表面與內部均可見RGDS標記的橙紅色熒光及rt-PA標記的綠色熒光(圖2F、2G)。

表3 加入順序不同的配體與微泡雙負載結合率的比較(±s)

表3 加入順序不同的配體與微泡雙負載結合率的比較(±s)

配體加入順序雙負載結合率(%)先加RGDS后加rt-PA67.21±1.90*#先加rt-PA后加RGDS61.50±0.85*rt-PA與RGDS混勻加入68.26±1.75F值16.090P值0.004

注：*：與rt-PA與RGDS混勻加入相比，P<0.01；#：與先加rt-PA后加RGDS相比，P<0.01

3 討論

BAS橋接法在制備靶向微泡造影劑中備受關注[7]。本課題組應用BAS橋接法將RGDS及rt-PA與微泡進行連接，成功制備了RGDS/rt-PA雙負載靶向微泡[8]。本研究中，RGDS/rt-PA雙負載靶向超聲微泡的物理特性與裸微泡的差異無統計學意義，熒光顯微鏡下可見微泡攜rt-PA呈綠色指環狀熒光、攜RGDS呈橙紅色指環狀熒光，提示配體與微泡結合穩定，符合理想的靶向超聲造影劑要求[9]。

本研究中，RGDS及rt-PA與微泡單負載的結合率均較高，同一劑量梯度下rt-PA與微泡單負載的結合率均低于RGDS(P均<0.05)，可能是由于rt-PA在溶解過程中需加入吐溫80等助溶物質，后者可在生物素化過程中被同時標記[10]，占據部分結合位點，導致rt-PA與微泡的結合率降低。

本研究在明確單負載最佳結合率的基礎上，以不同順序加入配體構建雙負載微泡，結果顯示將兩種配體混勻同時加入微泡后的結合效率最高，與既往[11-12]研究結果不同，分析原因，可能是由于先加入的配體會優先與微泡結合，占據較多結合位點，導致后加入的配體與微泡的結合率降低。但本研究未觀察不同配比配體對微泡結合率的影響，亦未涉及配體間的微量調整及與微泡結合時的微量控制。

本研究中，RGDS及rt-PA劑量均為0.062 5 mg時，與微泡單負載的結合率最高，分別為(92.33±1.47)%和(82.36±1.82)%，而RGDS和rt-PA與微泡雙負載結合時的結合率明顯降低[(68.26±1.75)%]，與本課題組前期研究[13]結果一致，原因可能在于RGDS與rt-PA與微泡表面的鏈霉親和素結合時會競爭結合位點，產生一定競爭性抑制作用。

RGDS/rt-PA雙負載靶向微泡可通過RGDS引導rt-PA聚集在血栓周圍，實現靶向性溶栓；同時，由于rt-PA靶向性濃聚于血栓周邊，可在提高溶栓效率的前提下有效減少由于全身血藥濃度過高導致的藥物不良反應[12]。本研究將RGDS/rt-PA雙負載靶向微泡注入血栓模型后，超聲可見均勻分布的點狀高回聲，血栓邊界回聲明顯增強，提示微泡高度濃聚于血栓模型周圍；經沖洗處理后血栓模型表面仍可見微泡顯影，但回聲較前明顯減低，內部點狀高回聲分布體積也較前縮小，掃描電鏡及熒光顯微鏡結果提示攜帶相應熒光物質的RGDS/rt-PA雙負載靶向微泡可與血栓緊密結合，并起到溶栓作用[14]。