超聲評價微泡誘導超聲空化聯合血凝酶增強兔VX2肝癌微波熱消融作用

石 穎，谷 芬，楊 倩，賀建國，周曉東*

[1.山西醫科大學第二醫院超聲診斷科，山西 太原 030001；2.空軍軍醫大學(第四軍醫大學)西京醫院超聲診斷科，陜西 西安 710032]

近年來，超聲引導熱消融已經成為非手術治療肝癌的重要手段之一。肝臟及肝癌組織血流豐富，在熱消融治療過程中，部分熱能被血流帶走而產生“熱沉降效應”，導致少數腫瘤細胞不能被徹底殺滅[1]。本課題組前期實驗研究[2]表明，微泡誘導超聲空化聯合局部注射血凝酶可導致明顯的兔肝局部微血管損毀及血流減低，同時可增加兔正常肝臟低能量微波消融體積，增強消融效果[3]。本研究建立兔VX2肝癌模型，通過超聲檢查驗證消融后即刻微泡誘導超聲空化聯合血凝酶對兔肝VX2腫瘤微波熱消融的增強作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取35只健康新西蘭大白兔，購自空軍軍醫大學(第四軍醫大學)實驗動物中心，體質量2.0～2.5 kg，雌雄不限。腿部種植VX2腫瘤的荷瘤種兔2只，購自江蘇省連云港市第二人民醫院實驗室。本實驗經空軍軍醫大學(第四軍醫大學)倫理委員會批準(倫理委員會編號XJYYLL-2013016)。

1.2 動脈模型建立 經靜脈麻醉實驗兔后，選擇肝左葉較厚部位，以眼科鑷插入肝臟實質形成隧洞，將VX2瘤組織填入，以明膠海綿填塞后關閉腹腔。VX2腫瘤種植14天后，32只荷瘤兔存活，且肝VX2腫瘤最大徑均>1 cm。

1.3 主要儀器與試劑 CZ-960A型高聲壓超聲無創治療儀(四川綿陽索尼克電子有限責任公司)，治療探頭直徑2.5 cm，頻率831 KHz，峰值負壓4.6 MPa，平均聲強1.55 W/cm2，占空比0.22%，采取工作6 s、間歇6 s的交替治療模式。微波治療儀ECO-100C(南京億高微波系統工程有限公司)，工作頻率(2 450±20)MHz，采用A型治療針頭，針頭長度為3 mm。EchoLaser超聲儀(百勝醫療公司)，高頻探頭9 L，頻率4～11 MHz。超聲造影劑采用聲諾維(SonoVue)，微泡平均直徑為2.5 μm，使用前注入5 ml生理鹽水振蕩混勻。注射用血凝酶(商品名巴曲亭，蓬萊諾康藥業有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗動物分組 將32只荷瘤兔隨機分為4組：生理鹽水組(空化假輻照+生理鹽水)、血凝酶組(空化假輻照+生理鹽水+血凝酶)、空化組(超聲空化+微泡)和聯合組(超聲空化+微泡+血凝酶)，每組8只。

1.4.2 超聲空化治療 對實驗兔建立靜脈通道，麻醉成功后開腹，暴露肝左葉VX2腫瘤，以生理鹽水浸潤紗布固定。將消毒后的CZ-960A型高聲壓超聲無創治療儀治療探頭與VX2腫瘤緊密接觸。空化組和聯合組采用微量泵經兔耳緣靜脈以0.5 ml/min流率勻速泵入超聲造影劑聲諾維(0.2 ml/kg體質量)，同時使用超聲治療探頭進行空化輻照治療10 min；聯合組空化輻照后于肝左葉VX2腫瘤空化治療區注射血凝酶2 U，空化組不注射任何藥物。生理鹽水組和血凝酶組經靜脈通道持續泵入生理鹽水(0.2 ml/kg體質量)，同時使用超聲治療探頭進行空化假輻照10 min；血凝酶組假輻照后在肝左葉VX2腫瘤空化假輻照區注射血凝酶2 U，生理鹽水組不注射任何藥物。

1.4.3 微波消融治療 超聲空化治療完畢后即刻，對各實驗組兔肝左葉VX2腫瘤中心進針行微波消融治療，治療功率10 W，時間3 min。

1.5 療效評價 分別以灰階超聲和CEUS于治療前測量腫瘤，消融治療后測量消融區長度、寬度和厚度，計算腫瘤和消融區體積，體積=π/6×長度×寬度×厚度。以CDFI和CEUS觀察消融前腫瘤血流分布特征、消融后消融區內及消融邊緣殘留組織血流分布情況。

1.6 統計學分析 采用SPSS 13.0統計分析軟件。計量資料用±s表示。4組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法。消融前腫瘤體積灰階超聲與CEUS間比較采用兩獨立樣本t檢驗,消融后消融區體積灰階超聲與CEUS間比較采用配對t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 灰階超聲 治療前，兔VX2肝癌表現為低回聲結節，見圖1A。4組間腫瘤體積差異無統計學意義(P均>0.05)，見表1。消融后，消融區超聲表現為組織回聲增強，可見片狀分布的粗大點狀強回聲，見圖1B。消融后，4組間灰階超聲測量消融區體積總體差異有統計學意義(P<0.001)；兩兩比較，聯合組消融區體積大于其他3組(P均<0.05)，空化組消融區體積大于生理鹽水組和血凝酶組(P均<0.05)，生理鹽水組與血凝酶組體積差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2 CDFI結果 4組兔治療前腫瘤均可見豐富的血流信號，27只見明顯的環繞血流分布與散在的短棒狀血流信號，見圖1C，5只見短棒狀或條索樣血流分布。消融后，聯合組腫瘤實質內均未顯示血流信號，生理鹽水組、血凝酶組和空化組部分腫瘤實質消融區邊緣可見點狀血流信號分布，見圖1D。

2.3 CEUS結果 治療前CEUS示兔肝VX2腫瘤動脈期迅速增強，門靜脈期快速消退，表現為典型的“快進快出”特征，見圖1E。治療前CEUS測量4組腫瘤體積差異無統計學意義(P>0.05)，CEUS與灰階超聲測量4組腫瘤體積差異均無統計學意義(P均>0.05)，見表1。

表1 4組兔VX2肝癌消融前腫瘤體積和消融后消融區體積比較(±s，n=8)

表1 4組兔VX2肝癌消融前腫瘤體積和消融后消融區體積比較(±s，n=8)

組別消融前腫瘤體積(cm3)灰階超聲CEUSt值P值消融后消融區體積(cm3)灰階超聲CEUSt值P值生理鹽水組1.90±0.691.93±0.820.0710.9440.25±0.150.39±0.1710.478<0.001血凝酶組1.64±1.261.68±1.250.0740.9420.31±0.130.43±0.149.571<0.001空化組1.88±0.882.01±0.830.3570.7250.83±0.281.02±0.349.187<0.001聯合組1.30±0.421.48±0.490.9380.3592.40±0.352.95±0.4412.630<0.001F值1.1270.827——136.100128.560——P值0.3500.487——<0.001<0.001——

圖1 空化組實驗兔消融治療前后腫瘤超聲表現 A.治療前，灰階超聲示腫瘤呈不均質低回聲(箭)； B.消融后，灰階超聲示消融區內片狀分布粗大點狀強回聲(箭)； C.治療前，CDFI示腫瘤內多發短棒樣血流信號(箭)； D.消融后，CDFI示消融區內血流信號消失，邊緣可見殘留血流信號(箭)； E.治療前，CEUS示腫瘤動脈期呈高增強(箭)； F.消融后，CEUS示消融區內無增強，邊緣見與CDFI圖像相對應的條帶狀殘留血供(箭)

圖2 兔肝VX2腫瘤消融治療后CEUS聲像圖 A.生理鹽水組； B.血凝酶組； C.空化組； D.聯合組

消融后，4組實驗兔消融區內凝固壞死的組織均表現為造影劑充盈缺損，見圖1F。聯合組腫瘤實質部分均無增強，生理鹽水組、血凝酶組和空化組部分腫瘤實質消融區邊緣可見少量殘余活性組織，呈典型的“快進快出”表現。CEUS測量4組間消融區體積總體差異有統計學意義(P<0.001)；兩兩比較，聯合組消融區體積大于其他3組(P均<0.05)，空化組大于生理鹽水組和血凝酶組(P均<0.05)，生理鹽水組與血凝酶組間差異無統計學意義(P=0.770)，見圖2。與灰階超聲測量的消融區體積相比，各組CEUS測量值均較大(P均<0.05)，見表1。

3 討論

目前超聲引導下熱消融治療已被臨床廣泛認可，但單次消融體積有限，常導致消融不徹底、腫瘤易復發等不良后果。減少肝癌及周圍肝組織的血供，降低“熱沉降”效應，有利于提高熱消融的效率[4-6]。研究[7]發現微泡誘導的超聲空化可降低局部肝臟的血流供應，動物實驗[8-9]發現超聲造影劑微泡可增強兔VX2肝癌HIFU消融區的體積，且微泡在低強度超聲作用下產生的空化效應可增強兔VX2肝癌激光消融效果[10]。Liu等[11]發現超聲空化聯合酒精消融兔正常肝臟，可較單純酒精消融提高約10倍消融體積。為進一步降低局部血流灌注，本課題組前期研究[2-3]發現，在超聲空化基礎上局部注射血凝酶，可顯著減少局部正常肝臟血流量，提高消融效果。在此基礎上，本研究采用兔肝VX2腫瘤模型，使用超聲空化聯合血凝酶，以降低“熱沉降”效應，結果發現聯合組消融體積較生理鹽水組明顯增大，提高約7倍，較單純空化治療組提高約2.5倍。分析原因，兔VX2肝癌血供豐富，雖然腫瘤微血管對微泡誘導的超聲空化敏感[12-13]，但所造成的微血管壁機械性損傷屬暫時性，加入血凝酶可更有效地降低局部血流量、提高熱消融靶區的熱能沉積，增大局部熱消融的體積。

本研究治療前CEUS測量的腫瘤體積與灰階超聲測量體積比較差異無統計學意義，原因可能為兔VX2腫瘤體積較小，且大多有包膜，因此測量差異不明顯；且消融時產生氣化，使消融區邊界模糊，對比度差，故灰階超聲的測量誤差較大。CEUS使用的超聲造影劑僅在血管腔內流動，不進入組織細胞間隙，是真正的血池示蹤劑[14-15]，CEUS可清晰顯示凝固壞死的組織與周邊正常組織分界，使測量更為精確，因此消融后兩者測量的消融區體積差異有統計學意義。

在顯示血流方面，CDFI和CEUS均可顯示組織內部的血流信號，但在位置較深和血流速度緩慢的組織中，CDFI顯示組織血流的效果有限[16]。超聲造影劑可清晰顯示腫瘤和組織中的血流灌注，尤其對于顯示熱消融治療后腫瘤殘余組織的血流狀況，CEUS明顯優于CDFI。

綜上所述，本研究結果表明微泡誘導的超聲空化聯合血凝酶可增大兔VX2肝癌微波熱消融后消融范圍。CEUS可準確顯示腫瘤及消融區體積大小，并可檢測消融區是否有殘留組織，對評估腫瘤消融后療效具有較高準確性。