KLF16對胃癌細胞增殖、克隆能力的影響及機制

顧清，張莉，張新星，代小松，陳和平

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院，成都610072)

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，每年死亡病例數約68萬，其中約50萬在中國[1]。多數胃癌患者就診時已處于中晚期，以手術切除為基礎并輔助放化療的綜合治療方案是目前主要的臨床治療策略，然而放化療耐藥、對其他組織器官的侵襲等嚴重制約了胃癌患者的治療效果，胃癌患者的預后不佳，臨床亟需尋找新的與胃癌治療相關的生物靶分子[2]。Krüppel樣轉錄因子(KLF)可與富含GC序列的啟動子區結合，調節基因表達。KLF在各種生理和病理過程中發揮重要作用，如血管形成[3]、腫瘤形成[4,5]等。研究證實，KLF2可通過上調p15和p21基因表達，抑制腫瘤增殖[6]。KLF16是Kaczynski等[7]在2002年鑒定的一個新的KLF家族成員，可抑制胰腺癌細胞增殖，而關于KLF16在胃癌中的表達文獻報道甚少。2016年1月～2017年10月，我們檢測了KLF16在人胃癌細胞中的表達，并探討了其對胃癌細胞增殖、克隆能力的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃上皮細胞株GES-1、人胃癌細胞株BGC-823、SGC7901、HCG-27和AGS(中國科學院上海細胞庫)，RPMI 1640培養基、胎牛血清(FBS)和雙抗(美國Gibco公司)，免疫組化試劑盒(上海經科化學科技有限公司)，兔抗人KLF16多克隆抗體(ab187973,IHC-P，美國Abcam公司)，RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，Real-time PCR引物序列(上海生工生物工程技術服務有限公司)，脂質體Lipofectamine 3000(美國Invitrogen公司)，shRNA(上海吉瑪制藥技術有限公司)，CCK-8溶液(上海翊圣生物科技有限公司)，低熔點瓊脂糖(北京凱瑞基生物科技有限公司)，RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒和ECL發光液(上海碧云天生物技術有限公司)，兔抗人KLF16多克隆抗體(ab175892，美國Abcam公司)，兔抗人p21單克隆抗體(ab109520，美國Abcam公司)，兔抗人周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)單克隆抗體(ab108357，美國Abcam公司)，兔抗人GAPDH多克隆抗體(ab9485，美國Abcam公司)，HRP標記的羊抗兔二抗(北京博奧森生物技術有限公司)。紫外分光光度計(ND-2000，美國Thermo公司)，熒光定量PCR儀(7600，美國ABI公司)，酶標儀(ELX800，美國伯騰儀器有限公司)，凝膠成像儀(2500R，上海天能科技有限公司)。

1.2 細胞培養 取人胃上皮細胞株GES-1及人胃癌細胞株BGC-823、SGC7901、HCG-27、AGS，均培養于RPMI1640培養基(含雙抗+10% FBS)，置于37 ℃、5% CO2培養箱中，取復蘇后第4～10代細胞進行試驗。

1.3 細胞中KLF16 mRNA相對表達量檢測 取約5×104個處于對數生長期的BGC-823和SGC-7901細胞，每種細胞分為3組，接種于6孔板中，24 h后，sh-KLF16 1#、2#、3#組采用脂質體Lipofectamine 3000，分別將sh-KLF16 1#(5′-AGC GCT TCA CCC GCA GTG A-3′)、sh-KLF16 2#(5′-GTG CTC ATG GCC ATC TCT T-3′)、sh-KLF16 3#(5′-CGC ACC TAA AGT CGC ACCT-3′)轉染至細胞中，sh-NC組將shRNA無關序列轉染至細胞中，以不轉染shRNA的細胞為空白對照組。操作步驟參照試劑說明書。轉染后12 h，Real-time PCR法檢測KLF16 mRNA相對表達量。試驗重復3次?；虮磉_量以2-ΔΔCt法計算。

1.4 細胞增殖活性檢測 采用CCK-8法。將轉染后的細胞懸液，接種至96孔板中，接種密度約8 000/孔，每組設置3個復孔，24、48和72 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，培養箱中繼續孵育4 h，在酶標儀450 nm波長處測定吸光度值，計算3個復孔的平均值。試驗重復3次后，進行統計分析。

1.5 細胞克隆數目測算 制備1.2%和0.7%低熔點瓊脂糖溶液，高壓滅菌后，置于40 ℃水浴；按1∶1比例，制備1.2%低熔點瓊脂糖溶液和2×RPMI 1640培養基(2×雙抗和20%FBS)的混合液，取混合液2 mL至6孔板中，冷卻凝固備用；取轉染后的單細胞懸液，細胞計數后，調整細胞密度為1×106/L；按1∶1比例，制備0.7%低熔點瓊脂糖溶液和2×RPMI 1640培養基(含20% FBS和2×雙抗)的混合液，再加入細胞懸液200 μL，充分混勻，取適量(約500個細胞)加入至上述6孔板中，形成雙層瓊脂層，凝固后，置于培養箱中10～14 d，觀察并記錄細胞克隆數目。試驗重復3次后，進行統計分析。

1.6 細胞中KLF16、p21和CDK4蛋白表達檢測 采用Western blotting法。收集各組細胞約1×106個，加入RIPA蛋白裂解液150 μL，充分裂解后，提取細胞全蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。SDS-PAGE膠電泳分離蛋白后，濕轉法將蛋白轉到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫振蕩封閉30 min，TBS-T溶液洗滌1次，分別加入兔抗人KLF16多克隆抗體，兔抗人p21單克隆抗體，兔抗人CDK4單克隆抗體，兔抗人GAPDH多克隆抗體室溫孵育1 h。TBS-T溶液洗滌3次，分別加入HRP標記的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，TBS-T溶液洗滌3次，ECL發光液進行化學發光顯影，凝膠成像儀對蛋白條帶進行觀察，獲取圖像，采用Image Lab軟件對圖像進行灰度分析，計算目的蛋白與內參蛋白的灰度比值。試驗重復3次后，進行統計分析。

2 結果

2.1 各組KLF16 mRNA相對表達量比較 BGC-823細胞中，空白對照組，sh-NC組，sh-KLF16 1#、2#、3#組KLF16 mRNA相對表達量分別為1.13±0.10、1.06±0.15、0.57±0.11、0.72±0.14、0.39±0.13，SGC-7901細胞中，空白對照組，sh-NC組，sh-KLF16 1#、2#、3#組KLF16 mRNA相對表達量分別為1.09±0.12、1.02±0.14、0.59±0.15、0.53±0.11、0.31±0.15；兩種細胞中，sh-KLF16 #3組的KLF16 mRNA相對表達量低于sh-KLF16 #1組和sh-KLF16 #2組(P均<0.05)。

2.2 各組細胞增殖活性比較 在BGC-823和SGC-7901細胞中，與空白對照組和sh-NC組相比，sh-KLF16 3#組轉染48、72 h細胞增殖活性低(P均<0.05)。見表1。

表1 各組轉染24、48、72 h后細胞增殖活性比較

注：與同時點空白對照組和sh-NC組相比，*P<0.05。

2.3 各組細胞克隆數目比較 BGC-823細胞中，空白對照組、sh-NC組、sh-KLF16 3#組細胞克隆數目分別為(180.45±19.32)、(189.83±22.43)、(109.32±24.31)個；SGC-7901細胞中，空白對照組、sh-NC組、sh-KLF16 3#組細胞克隆數目分別為(148.41±21.43)、(152.95±24.75)、(87.82±18.43)個；sh-KLF16 3#組細胞克隆數目低于空白對照組、sh-NC組(P均<0.05)。見圖1。

圖1 平板克隆形成試驗檢測各組細胞克隆形成能力(×200)

2.4 各組細胞中KLF16、p21和CDK4蛋白表達比較 BGC-823細胞中，空白對照組KLF16、p21、CDK4蛋白相對表達量分別為1.13±0.10、0.84±0.12、1.21±0.18，sh-NC組分別為1.15±0.12、0.79±0.15、1.36±0.32，sh-KLF16 3#組分別為0.21±0.03、1.34±0.21、0.31±0.11。SGC-7901細胞中，空白對照組KLF16、p21、CDK4蛋白相對表達量分別為1.02±0.09、0.78±0.11、1.13±0.08，sh-NC組分別為1.09±0.13、0.69±0.22、1.09±0.14，sh-KLF16 3#組分別為0.26±0.07、1.38±0.28、0.42±0.08。在BGC-823和SGC-7901細胞中，干擾KLF16基因表達后，p21蛋白表達增加，而CDK4蛋白表達下降(P均<0.05)。

3 討論

胃癌是最常見的胃腸道惡性腫瘤之一，其發病率僅次于肺癌[8]。手術切除可有效改善胃癌患者的預后，但患者的5年總生存率僅29%左右。目前已有多個靶向治療藥物進入臨床試驗階段，但效果并不理想[9,10]，臨床仍亟需尋找能有效靶向治療胃癌的生物靶標。

KLF是真核細胞中一類含有鋅指結構的轉錄因子，以細胞周期和啟動子依賴性的方式參與調節基因轉錄。KLF在腫瘤形成和惡性進展中發揮多種功能，如KLF2通過調節p15和p21表達，在肺癌中發揮抑癌基因功能[6]；KLF4可抑制胰腺癌[11]、胃癌[12]和結腸癌[13]等腫瘤細胞增殖。此外，KLF15被證實在乳腺癌等多種腫瘤細胞中發揮抑癌基因功能[14]。目前，關于KLF16的研究主要集中于代謝和內分泌方面[15]，在視網膜神經節細胞中，KLF16可抑制神經突起生長，導致軸突冠萎縮[16]；此外，KLF16可減少PPARγ表達進而抑制脂肪生成[17]，而在KRAS癌基因突變的腫瘤細胞中，KLF16可抑制細胞增殖[18]。

本研究結果顯示，在BGC-823和SGC-7901細胞中干擾KLF16基因表達后，細胞的增殖和克隆形成能力被顯著抑制，鑒于現有的文獻報道，推測KLF16可能參與了細胞周期調節。研究證實，p21蛋白通過其N末端特異性地與PCNA、Cyclin-CDK結合，抑制CDK活性，阻滯細胞周期，進而抑制細胞增殖；CDK4蛋白正向調控細胞周期，促進細胞由G1期向S期轉化，CDK4高表達促進多種腫瘤的惡性進展[18]。本研究中，Western blotting試驗結果發現，干擾BGC-823和SGC-7901細胞中KLF16基因表達，可顯著增加p21蛋白表達，同時降低CDK4蛋白表達，提示KLF16表達下降，可能導致了細胞周期阻滯，進而抑制了細胞增殖。

綜上所述，干擾KLF16基因表達，可抑制細胞增殖和克隆形成能力。KLF16發揮癌基因的功能可能是通過上調CDK4和下調p21表達，導致細胞周期阻滯實現。KLF16可作為胃癌患者治療和預后預測的生物靶標，后續研究將繼續探討KLF16對細胞周期調節的具體內在機制。