非小細胞肺癌組織中Syncytin-1的表達變化及與患者預后的關系

傅楊，夏西燕，李曉慧，莊學偉

(1 山東大學齊魯醫院，濟南250012；2 濟南市婦幼保健院；3 濟南護理職業學院)

肺癌是嚴重危害人類生命健康的疾病，在全球范圍內是發病率和病死率最高的惡性腫瘤，盡管肺癌的診治水平不斷提高，但5年生存率仍然較低[1]。Syncytin-1是人內源性逆轉錄病毒W基因家族(HERVWE1)的成員，定位于染色體7q21-22[2]。體外實驗的相關研究顯示，在多種人類惡性腫瘤中觀察到Syncytin-1的過度表達，包括乳腺癌[3]、子宮內膜癌[4]、卵巢癌[5]、結直腸癌[6]、白血病和淋巴瘤[7]等。Syncytin-1與非小細胞肺癌(NSCLC)的相關性國內外少見報道，本研究應用免疫組織化學法檢測了Syncytin-1在NSCLC癌組織和癌旁組織中的表達水平，并探討了其與患者預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇山東大學齊魯醫院1999年1月～2001年10月收治并經病理證實為NSCLC的患者30例，其中男23例、女7例，年齡37～75(57.87±1.72)歲，鱗狀細胞癌16例，腺癌14例；TNM分期中Ⅰ期12例、Ⅱ期6例、Ⅲ期12例；出現淋巴結轉移15例、無淋巴結轉移15例。術中取患者的癌組織及癌旁組織(癌組織旁1～2 cm)，離體后半小時內用10%中性甲醛固定12～24 h，脫水、石蠟包埋、制片。

1.2 NSCLC癌組織及癌旁組織中Syncytin-1表達檢測 采用免疫組織化學法。將相應的蠟塊切片進行免疫組織化學染色，兔抗人Syncytin-1單克隆抗體購于美國GeneTex公司，抗兔IgG抗體購于北京中杉金橋生物技術有限公司。具體步驟為：①將適量的EDTA修復液加入高壓鍋內，將電磁爐的功率調整至1 600 W對高壓鍋進行預熱，待修復液沸騰后將切片放入鍋內，并將電磁爐功率降至900 W，修復2.5 min，待修復液及切片冷卻至室溫后取出切片架，PBS沖洗3次，每次3 min；②滴加3% H2O2100 μL，以此阻斷內源性過氧化物酶的作用，37 ℃孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min；③滴加一抗溶液(兔抗人Syncytin-1單克隆抗體1∶100稀釋)50 μL，室溫孵育2 h左右，PBS沖洗3次、每次3 min；④滴加試劑1(Polymer Helper)50 μL，37 ℃溫箱孵育20 min，PBS沖洗3次、每次3 min；⑤滴加二抗溶液(抗兔IgG)50 μL，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次、每次3 min；⑥DAB溶液顯色3～5 min；⑦流水漂洗、復染、分色、返藍、脫水、透明、封片；⑧顯微鏡下觀察以評估染色質量和結果，拍照。陽性結果判定：Syncytin-1蛋白陽性染色為細胞膜和細胞質著棕黃色，細胞核用蘇木精復染為藍色。染色結果分為四類：“-”組織標本無陽性細胞；“+”組織標本的陽性細胞率<25%，著色較弱；“++”組織標本的陽性細胞率為25%～50%，著色適中；“+++”組織標本的陽性細胞率>50%，著色較深。Syncytin-1陽性細胞率=著棕黃色的細胞數/總細胞數(蘇木精染成藍色)×100%。

2 結果

2.1 NSCLC癌組織及癌旁組織中Syncytin-1陽性細胞率比較 所有細胞的細胞核被蘇木精復染為藍色，而Syncytin-1陽性細胞膜和細胞質被染成棕黃色，陰性的細胞膜和細胞質不著色。NSCLC癌組織及癌旁組織Syncytin-1陽性細胞率分別為35.41%±0.22%、2.17%±0.03%，NSCLC癌組織中Syncytin-1陽性細胞率高于癌旁組織(P<0.01)。見圖1。以Syncytin-1陽性細胞率25%為界，陽性細胞率≥25%的患者為Syncytin-1高表達組，陽性細胞率<25%的患者為Syncytin-1低表達組,分別為19、11例。

圖1 NSCLC癌組織及癌旁組織中Syncytin-1陽性細胞率

2.2 5年存活組和5年死亡組癌組織中Syncytin-1陽性細胞率比較 5年存活組和5年死亡組Syncytin-1陽性細胞率分別為23.30%±0.16%、44.67%±0.21%。5年存活組Syncytin-1陽性細胞率低于5年死亡組(P<0.01)。見圖2。

2.3 生存分析 Syncytin-1低表達組5年內死亡3例，占27.3%；Syncytin-1高表達組5年內死亡14例，占73.7%，Syncytin-1高表達組中的死亡比例高于Syncytin-1低表達組(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲線分析發現，Syncytin-1高表達組平均生存期為28個月，而Syncytin-1低表達組為64個月，兩組比較，P<0.01。見圖3。Cox比例風險回歸模型分析結果顯示，Syncytin-1陽性細胞率和臨床分期是NSCLC死亡的危險因素(P均<0.05)。見表1。

圖2 5年存活組和5年死亡組Syncytin-1陽性細胞率

圖3 Syncytin-1高表達與低表達患者生存曲線(Kaplan-Meier法)表1 NSCLC患者多變量Cox回歸分析結果

變量 HR 95%CI PSyncytin-1 7.824 1.138～53.814 0.037性別 0.678 0.176～2.617 0.573年齡 0.639 0.179～2.273 0.489原發腫瘤 1.258 0.506～3.126 0.621區域淋巴結 0.449 0.160～1.263 0.129臨床分期 8.158 2.211～30.093 0.002

3 討論

功能性的HERVWE1包括完整的長末端重復序列的非編碼區和組特異性抗原、聚合酶、包膜(env)基因，只有全長env基因可以編碼出有功能性的糖蛋白即Syncytin-1，由538個氨基酸組成。Syncytin-1已經進化為人類胎盤形態發生所必需的基因，借助于細胞融合功能將細胞滋養層細胞融合成合體滋養層細胞[2]。在我國，肺癌已成為癌癥死亡的首要病因，且發病率和病死率還在不斷增長。最新資料表明，美國2010年新發腫瘤患者150多萬，其中肺癌患者22萬余例，約占總數的15%，居各類癌癥之首[8]。在美國肺癌已經是癌癥患者死亡的主要原因，約75%的患者發現時已經處于中、晚期，所有階段的5年生存率為15.6%，包括手術、化療、放療干預在內的治療對原發性肺部惡性腫瘤患者的長期存活率大多沒有改善作用[9]。NSCLC約占原發性肺癌的85%[10]，預后很差。腫瘤的發生是一個多階段多因素的結果，其中包括癌基因的激活和抑癌基因的失活，有些在胎兒期才表達的蛋白質在患癌后顯著升高，如癌胚抗原和甲胎蛋白等。

據國內外相關文獻報道，Syncytin-1在多種人類癌癥組織中有異常表達。Strissel等[4]發現，與早期和高分化癌癥相比，Syncytin-1在晚期和低分化的子宮內膜癌中過度表達。Larsson等[3]分析165例絕經前期淋巴結陰性的乳腺癌患者腫瘤組織中Syncytin的表達情況，其中38%的乳腺癌患者為陽性。Sun等[7]發現，Syncytin-1在急性髓細胞白血病中表達增加，并且Syncytin-1在四種白細胞(即原始細胞、粒細胞、淋巴細胞和單核細胞)中表達均增加。Maliniemi等[11]還發現，在蕈樣真菌病活組織檢查中存在Syncytin-1蛋白的表達，并且在惡性淋巴細胞中也有表達，特別是表皮性的惡性淋巴細胞中，我們通過免疫組織化學法證明，在NSCLC組織中有中至高等強度的Syncytin-1蛋白表達，而在癌旁組織中多不表達，這與Syncytin-1在其他人類惡性腫瘤組織中的表達報道一致。影響肺癌5年生存率的因素是多方面的，需要根據患者的全身情況、心理狀態、腫瘤分期、組織學類型、惡性程度以及有無轉移等因素綜合考慮。Larsson等[3]報道，Syncytin表達較強的乳腺癌患者有更高的無復發生存率，并且可作為一個獨立的預后指標。Larsen等[6]對140例結直腸癌病例進行回顧性分析，發現Syncytin在結直腸癌中均有表達，但在直腸癌中Syncytin表達增加伴隨著總體生存率的下降，而在結腸癌中并無此現象。本研究顯示，Syncytin-1在5年死亡組的表達高于5年存活組，提示Syncytin-1可以作為NSCLC的預后指標，表達高則預后不良。Syncytin-1高表達組死亡患者比例高于Syncytin-1低表達組，平均生存期低于Syncytin-1低表達組。我們將Syncytin-1陽性細胞率、患者性別、年齡、腫瘤的TNM分期以及臨床分期等諸多因素納入Cox比例風險模型，結果顯示Syncytin-1陽性細胞率和臨床分期是NSCLC死亡的危險因素。上述這些研究成果提示 Syncytin-1與NSCLC患者預后有關。

最新證據表明，Syncytin-1是一種多功能的蛋白質。癌細胞和內皮細胞均表達Syncytin-1的受體ASCT2，抗Syncytin-1治療降低了Syncytin-1的表達，并抑制了內皮細胞與乳腺癌細胞之間的融合，這表明Syncytin-1與腫瘤細胞和內皮細胞的融合有關[12]。除細胞融合功能外，Syncytin-1還具有一些重要的非融合功能，Syncytin-1參與免疫抑制，可能有助于母體適應懷孕過程[13]。Syncytin-1在TGF-β1和TGF-β3存在的情況下可促進細胞增殖，這表明Syncytin-1是細胞增殖過程所必需的[14]。胎盤滋養層的生存似乎依賴于足夠水平的Syncytin-1，因為敲減Syncytin-1會誘導廣泛的細胞凋亡[15]。在病理條件下，Syncytin-1表達的下降可能導致細胞死亡和滋養細胞脫落，這是在先兆子癇胎盤中經常觀察到的現象[16]。這些非融合功能(免疫抑制、細胞增殖、抗凋亡)可以被用來解釋Syncytin-1在人類惡性腫瘤組織中過度表達的原因。

總之，Syncytin-1在NSCLC組織中過度表達，且與患者的預后有關，此為肺癌的診斷、治療、預后判斷提供了實驗依據，為NSCLC發病機制的探索揭開了新的曙光，但Syncytin-1的病理生理功能以及在NSCLC中的表觀遺傳調控的確切分子機制仍需進一步研究探討。