血清微小RNA-155聯(lián)合IL-35水平檢測對膿毒癥患者病情及預(yù)后的評估價值

張紅玉，王佳，孫曉靖

(新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，烏魯木齊830000)

膿毒癥是一種發(fā)病率和病死率較高的臨床疾病，盡管發(fā)病機制尚未完全探明，但炎癥反應(yīng)過度導(dǎo)致炎癥“瀑布”反應(yīng)，致使形成全身炎癥反應(yīng)綜合征，被認(rèn)為是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機制[1]。盡管治療措施已有很大進步，但其病死率仍較高。目前膿毒癥臨床治療原則為早期識別病情嚴(yán)重患者，及時予以干預(yù)，改善預(yù)后，降低病死率[2]。臨床常用的降鈣素原(PCT)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、急性生理學(xué)與慢性健康狀況評分系統(tǒng)(APACHEⅡ)等指標(biāo)，對于評估膿毒癥患者病情及預(yù)后的臨床價值較差，因此臨床研究找尋能早期診斷、準(zhǔn)確判斷膿毒癥病情及預(yù)后的最佳指標(biāo)至關(guān)重要[3]。近年，微小RNA-155(miRNA-155)及IL-35引起臨床高度關(guān)注，其中IL-35參與感染及炎癥等多種疾病發(fā)生發(fā)展，而miRNA-155通過調(diào)控多條重要炎癥信號通路發(fā)揮促炎效應(yīng)，因此miRNA-155及IL-35被認(rèn)為是具有較好潛在價值的新型血清標(biāo)記物[4]。目前尚未見膿毒癥患者血清miRNA-155及IL-35水平動態(tài)變化以及其對病情及預(yù)后評估價值的報道，本研究對此進行了相關(guān)探討，為臨床進一步探討改善膿毒癥預(yù)后提供循證依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年6月～2017年12月在新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院ICU住院治療的危重病患者82例，其中男44例、女38例，年齡(54.6±8.3)歲，體質(zhì)量指數(shù)(18.1±1.4)kg/m2，既往糖尿病史23例、高血壓史37例。膿毒癥患者40例(觀察組)、無膿毒癥患者42例(對照組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)符合美國重癥監(jiān)護醫(yī)學(xué)學(xué)會(SCCM)及歐洲重癥醫(yī)學(xué)會(ESICM)(2003年)聯(lián)合確定的膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②年齡18～70歲；③能堅持隨訪，臨床資料完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：①病情危重，不能確定14 d生存狀況；②腦、肺、肝、腎等嚴(yán)重臟器功能不全；③嚴(yán)重糖尿病并發(fā)癥或腫瘤晚期；④研究期內(nèi)自行放棄治療及臨床資料不完整者。兩組年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)以及既往內(nèi)科疾病史等有可比性。

1.2 治療方法 觀察組參照SCCM及ESICM聯(lián)合確定的膿毒癥診療指南，主要依據(jù)血培養(yǎng)或分泌物培養(yǎng)或涂片結(jié)果進行有效抗感染治療、治療原發(fā)疾病，糾正水電解質(zhì)酸堿平衡、加強營養(yǎng)支持對癥等處理。對照組治療原則為維系生命體征穩(wěn)定、治療原發(fā)疾病以及營養(yǎng)支持對癥處理。

1.3 血清IL-35、PCT以及IL-6水平檢測 分別于治療第1、7、14天，兩組均于清晨空腹采集肘靜脈血3 mL，2 000 r/min離心10 min，分離所得血清置于-80 ℃冰箱備檢。采用ELISA法檢測血清IL-35、PCT以及IL-6水平。IL-35、PCT以及IL-6測定試劑盒購自美國BD公司，各標(biāo)記物檢測操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進行。

1.4 健康狀況評價 兩組分別于治療第1、7、14天均進行APACHEⅡ評分，主要為急性生理評分(APS)、年齡及慢性生理評分(GPS)三部分組成，其中APS為12項參數(shù)，每項分值為0～4分，總分值0～60分；年齡分值0～6分；CPS 2～5分，總APACHEⅡ評分值0～71分。

1.5 血清miRNA-155的檢測 分別于治療第1、7、14天，采用實時熒光定量PCR法。采用miRNA檢測試劑盒(購自美國Life Technology公司)將所得miRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA鏈，具體操作以及反應(yīng)體系和條件依據(jù)廠家說明書確定。內(nèi)參為小核RNA U6(snRNA U6)，其上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miRNA-155上游引物：5′-CGTTAATGCTAATCGTGATAG-3′，下游引物：5′-GCAGGGTCCGAGG-3′。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃、5 min；95 ℃、10 s變性，60 ℃、20 s退火，72 ℃、20 s延伸，40個循環(huán)。以2-ΔΔCt表示觀察組miRNA-155相對于對照組的表達水平，ΔCt=Ct目標(biāo)-Ct內(nèi)參。

1.6 隨訪 隨訪3個月，隨訪間隔1個月，記錄患者的死亡例數(shù)。根據(jù)患者預(yù)后結(jié)局分為生存組54例、死亡組28例。

2 結(jié)果

2.1 兩組不同時間血清miRNA-155、IL-35、PCT、IL-6及APACHE Ⅱ評分比較 見表1。對照組不同時間血清miRNA-155、IL-35、PCT、IL-6及APACHE Ⅱ評分比較，P均>0.05。觀察組miRNA-155、IL-35、PCT、IL-6及APACHE Ⅱ評分隨治療時間延長而逐漸降低(P均<0.05)，但同一時間點觀察組各指標(biāo)均大于對照組(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組不同時間血清miRNA-155、IL-35、PCT、IL-6及APACHEⅡ評分比較

2.2 相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示，膿毒癥患者血清miRNA-155與血清PCT、IL-6及APACHEⅡ評分呈正相關(guān)(r分別為0.818、0.725、0.571，P均<0.05)，血清IL-35與上述各指標(biāo)呈正相關(guān)(r分別為0.865、0.858、0.564，P均<0.05)。

2.3 生存組與死亡組血清miRNA-155與IL-35比較 生存組血清miRNA-155水平為2.92±0.91，死亡組為5.85±1.07，兩組比較，t=3.210，P=0.018；生存組血清IL-35水平為(459.7±39.5) pg/mL，死亡組為(768.1±43.2) pg/mL，兩組比較，t=3.115，P=0.023。

2.4 預(yù)后影響因素 以隨訪3個月生存率為應(yīng)變量，年齡、血清miRNA-155、IL-35、PCT、IL-6及APACHEⅡ評分為自變量，應(yīng)用全模型多元Logistic回歸分析方法進行回歸分析，結(jié)果顯示血清miRNA-155、IL-35及PCT為膿毒癥患者預(yù)后的危險因素(表2)。

表2 臨床指標(biāo)多元Logistic回歸分析結(jié)果

2.5 血清miRNA-155與IL-35檢測對預(yù)后的評估價值 血清miRNA-155截斷值為3.50，預(yù)測膿毒癥患者隨訪3個月預(yù)后不良發(fā)生的曲線下面積(AUC)為0.796，P為0.041，靈敏度78.6%，特異度89.3%；血清IL-35截斷值為560 pg/mL，預(yù)測隨訪3個月預(yù)后不良發(fā)生的AUC為0.816，P為0.039，靈敏度77.9%，特異度90.1%；兩者聯(lián)合檢測預(yù)測膿毒癥患者隨訪3個月預(yù)后不良發(fā)生的AUC為0.853，P為0.031，靈敏度86.2%，特異度88.3%(見圖1)。

圖1 治療前血清miRNA-155與IL-35水平檢測預(yù)測膿毒癥患者預(yù)后的ROC曲線

3 討論

膿毒癥的發(fā)病機制極為復(fù)雜，目前公認(rèn)全身炎癥網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)是其中重要因素之一，由于感染等多種誘因?qū)е聶C體免疫失衡，被炎癥網(wǎng)絡(luò)進行級聯(lián)放大，最終導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征[1,2]。膿毒癥早期較為隱匿，出現(xiàn)明顯臨床癥狀后即便予以完善全面臨床治療措施，預(yù)后仍較差，病死率可達70%，因此加強對膿毒癥的早期預(yù)測評估，及時發(fā)現(xiàn)高危患者并給予干預(yù)，能進一步阻斷病情發(fā)展，改善患者預(yù)后[6,7]。

近年研究顯示，miRNA在維持機體自身穩(wěn)態(tài)、參與炎性疾病病理生理過程等方面具有重要效應(yīng)，其中miRNA-155是研究熱點，被認(rèn)為是膿毒癥炎癥網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)的平衡點參與病理生理發(fā)生發(fā)展過程，可作為早期診斷膿毒癥的敏感指標(biāo)，也可能是今后膿毒癥患者接受免疫調(diào)理以及基因治療的重要靶點[8～10]。國外膿毒癥實驗動物模型研究證實，miRNA-155在體內(nèi)免疫應(yīng)答調(diào)控過程中具有重要作用，主要是通過上調(diào)TNF-α水平，調(diào)節(jié)輔助性T細(xì)胞(Treg)的增殖以及T細(xì)胞亞群比例，促進炎癥反應(yīng)，從而對整個免疫網(wǎng)絡(luò)進行調(diào)節(jié)[11,12]。研究顯示，體內(nèi)miRNA-155表達水平與膿毒癥患者免疫失衡程度存在相關(guān)性，增加膿毒癥患者的病死率，對膿毒癥的病情嚴(yán)重程度也有一定預(yù)警作用[13]。

IL-35是新發(fā)現(xiàn)的具有較好潛在治療前景的抗炎因子，其參與多種炎癥疾病的免疫調(diào)節(jié)，主要是通過促進IL-10分泌，抑制IL-17以及IFN-γ的產(chǎn)生，從而有效抑制特異性免疫應(yīng)答，減輕機體炎癥反應(yīng)水平[14，15]。近年研究也發(fā)現(xiàn)，IL-35能有效地改善感染性疾病，延緩其本身導(dǎo)致的免疫炎癥反應(yīng)的發(fā)展，并且IL-35能通過上調(diào)誘導(dǎo)型Treg以增強機體對感染所致炎性反應(yīng)的耐受性，因此被認(rèn)為可作為膿毒癥診斷的血清標(biāo)志物[16,17]。

近年研究顯示，miRNA-155可能通過調(diào)控IL-35發(fā)揮免疫炎癥調(diào)控效應(yīng)[18]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-155與IL-35存在相互調(diào)節(jié)、相互影響，共同參與膿毒癥炎性反應(yīng)病理生理過程，因此臨床研究者推測通過動態(tài)檢測miRNA-155與IL-35，能有效對膿毒癥患者的診斷、病情嚴(yán)重程度以及預(yù)后進行評估，但目前尚未見臨床報道予以證實[4]。故為進一步了解膿毒癥患者血清miRNA-155與IL-35水平動態(tài)變化情況，以及與患者病情及短期預(yù)后結(jié)局的相關(guān)性，本研究通過分析我院ICU收治的膿毒癥患者臨床資料，以此為臨床更好治療膿毒癥提供循證依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，兩組年齡、性別、BMI及既往內(nèi)科病史等一般觀察指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示本研究系統(tǒng)誤差控制較好。在任意同一時間點觀察組血清miRNA-155、IL-35、PCT、IL-6及APACHEⅡ評分均高于對照組，表明在危重患者中miRNA-155與IL-35能有效鑒別膿毒癥，而隨著治療進行上述指標(biāo)呈進行性降低，提示血清miRNA-155與IL-35與病情程度可能存在正相關(guān)，其動態(tài)變化能提示膿毒癥的發(fā)展過程，對于治療方案修訂具有較好的臨床價值。進一步分析顯示，血清miRNA-155與IL-35水平與血清PCT、IL-6及APACHEⅡ評分均呈正相關(guān)，而PCT、IL-6及APACHEⅡ評分均是臨床常用的評估膿毒癥病情指標(biāo)，因此認(rèn)為，血清miRNA-155與IL-35水平能有效評估膿毒癥患者的病情。同時本研究顯示，對照組各項指標(biāo)無顯著性變化，提示血清miRNA-155與IL-35指標(biāo)對于非膿毒癥患者沒有特異性。本研究進行為期3個月的短期隨訪，分析顯示生存患者血清miRNA-155與IL-35水平低于死亡患者，提示血清miRNA-155與IL-35能夠預(yù)測膿毒癥患者的短期預(yù)后。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，血清miRNA-155與IL-35為膿毒癥的危險因素，提示對膿毒癥患者動態(tài)監(jiān)測血清miRNA-155與IL-35能對預(yù)后，尤其是生存情況進行有效評估。應(yīng)用ROC曲線評估治療前血清miRNA-155與IL-35水平預(yù)測膿毒癥患者的短期預(yù)后不良的臨床價值較佳，并且敏感度和特異度也較好。然而本研究的樣本量較少，研究結(jié)論仍需要大樣本多中心的臨床研究進一步證實。同時miRNA-155與IL-35在體內(nèi)進行相互調(diào)節(jié)的具體分子機制仍需進一步探討。