UPLC-MS/MS法同時測定人血漿中氯沙坦及其代謝物濃度

夏伯姍， 王振磊， 李岱慶， 王 曼， 王鴻芡， 張 梅，秦永平， 南 峰， 向 瑾

(1. 成都中醫(yī)藥大學藥學院 中藥材標準化教育部重點實驗室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137; 2. 四川大學華西醫(yī)院國家藥物臨床試驗機構臨床藥理研究室，四川 成都 610041;3. 揚子江藥業(yè)集團四川海蓉藥業(yè)有限公司，四川 成都 610041)

0 引 言

氯沙坦鉀（losartan potassium）是全球第一個上市的口服非肽類血管緊張素II受體拮抗藥，可以阻斷內源性及外源性的血管緊張素所產生的各種藥理作用，具有良好的抗高血壓療效。氯沙坦鉀口服吸收良好，經首過代謝后形成羧酸型活性代謝物及其他無活性代謝物[1]。主要活性代謝物氯沙坦羧酸（losartan carboxylic acid，LCA）的降壓作用為氯沙坦（losartan，LST）的10倍[2]，因此在研究氯沙坦生物等效性和藥代動力學時，同時測定氯沙坦和氯沙坦羧酸十分必要。同時，已有文獻報道氯沙坦鉀的藥動學受不同代謝酶基因多樣性的影響[3-4]，有必要積累更多的樣本數(shù)據(jù)并對不同來源制劑進行生物等效性評價以獲得更多臨床藥物應用的可靠信息。目前，國內外文獻報道測定氯沙坦及其代謝物濃度的主要方法有LC-UV法[5-7]和LC-MS法，其中LC-MS法又包括HPLC-MS法[8]、HPLC-MS/MS[9-18]法以及UPLC-MS/MS法[19-20]，血漿樣品預處理方法有液液萃取法[5-13]、固相萃取法[14]和沉淀蛋白法[15-20]。但目前報道的方法往往難以兼顧樣本前處理的簡便快速、進樣分析時間短、抗干擾能力強、靈敏準確、重現(xiàn)性好的高通量分析。本研究在以上方法的基礎上加以改進，采用同位素標記的藥物和代謝物作內標，乙腈沉淀蛋白后甲酸水溶液稀釋進樣，建立了UPLC-MS/MS法同時測定人血漿中LST及其代謝物LCA濃度方法。該方法血漿用量少，線性范圍廣，單個樣本分析時間僅為2.1 min，每日可檢測樣本數(shù)高達600個，可顯著提高分析人員的工作效率，適用于高通量的分析檢測工作，已成功用于氯沙坦鉀片（0.1 g）在健康志愿者的生物等效性研究。

1 材料與方法

1.1 方法

日本SHIMADZU SIL-30 AC型高效液相色譜儀；美國AB Sciex QTRAP 5500質譜儀；德國Eppendorf公司5810R低溫離心機；美國Millipore公司Milli-Q型純水儀；法國METTLER TOLEDO公司XP205R型十萬分之一電子分析天平；昆山市超聲儀器有限公司KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器；數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)為Analyst 1.6.3。

1.2 藥品與試劑

line-height:16.3ptLST標準品，中國藥品生物制品檢定所，批號100597-201102，純度99.9%；LCA標準品，加拿大Tlcpharmachem公司，批號1357-039A9，純度99.9%；d4-LST（d4-氯沙坦，d4-losartan）標準品，加拿大Tlcpharmachem公司，2286-087A3，純度98.6%；d4-LCA（d4-氯沙坦羧酸，d4-losartan carboxylic acid）標準品，加拿大Tlcpharmachem公司，批號2286-096，純度98.3%。乙腈、甲酸，美國Thermo Fisher公司，色譜純；氨水，成都科隆公司，分析純；超純水，美國Millipore公司Millipore型超純水器自制。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：SepaxGP-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），美國SEPAX公司；柱溫：40℃；流動相：A相為0.15%甲酸-0.04%氨水-水（超聲20 min后，加入0.01% 氨水），B相為0.15%甲酸-0.04%氨水-98%乙腈；梯度洗脫：0.01～0.60 min，B相48%～78%；0.60～0.90 min，B相78%～95%；0.90～0.95 min，B相95%～100%；0.95～1.50 min，B相保持100%不變；1.50～1.51 min，B相100%～48%；1.51～2.1 min，B相保持48%不變。流量：0.3 mL/min，進樣量：6 μL，進樣時長：2.1 min。

1.3.2 質譜條件

采用多反應離子監(jiān)測（MRM，multiple reaction monitoring），正離子模式掃描，ESI（電噴霧離子源，electron spray ionization），氣簾氣 35 psi（1 psi =6.895 kPa），霧化氣 40 psi，加熱輔助氣 60 psi，離子源溫度 500 ℃，噴霧電壓 5 500 V，去簇電壓 120 V，射入電壓 14 V，碰撞室射出電壓 13 V。LST、d4-LST的檢測離子對分別為（m/z）423.1→207.1、427.2→211.2，碰撞能量 18 V；LCA、d4-LCA的檢測離子對分別為（m/z）437.1→235.2、441.2→239.2，碰撞能量 23 V。

1.3.3 溶液的配制

LST、LCA標準曲線儲備液及工作液配制：精密稱取LST標準品10.18 mg（相當于LST 10 mg）、LCA標準品10.22 mg（相當于LCA 10 mg），分別置于兩個50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，獲得質量濃度均為200 μg/mL的LST、LCA標準曲線儲備液，并用純化水配制成LST為40.0，80.0，400，2 000，8 000，20 000，36 000，40 000 ng/mL，LCA為48.0，96.0，480，2 400，9 600，24 000，43 200，48 000 ng/mL的LST-LCA標準曲線系列工作液。置–35℃冰箱保存?zhèn)溆?。LST、LCA質控儲備液及工作液配制：精密稱取LST標準品10.24 mg（相當于LST 10 mg）、LCA標準品10.80 mg（相當于LCA 10 mg），分別置于兩個50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，獲得質量濃度均為200 μg/mL的LST、LCA質控儲備液，并用純化水配制成LST為40.0，120，3 200，32 000 ng/mL，LCA為48.0，144，3 840，38 400 ng/mL的LST-LCA質控工作液。置–35℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

內標d4-LST、d4-LCA儲備液及工作液的配制：取d4-LST 1 mg（1個包裝）置于10 mL容量瓶中，取d4-LCA標準品10 mg（1個包裝）置于50 mL容量瓶中，分別用甲醇溶解并定容至刻度，即得質量濃度為100 μg/mL的d4-LST儲備液、質量濃度為200 μg/mL的d4-LCA儲備液；置–35℃冰箱保存?zhèn)溆?。取d4-LST儲備液0.2 mL，d4-LCA儲備液0.125 mL，加入9.675 mL乙腈，獲得質量濃度為d4-LST-2 000 ng/mL和d4-LCA-2 500 ng/mL的內標中間工作液，再用乙腈將其稀釋成質量濃度為d4-LST-20 ng/mL 和d4-LCA-25 ng/mL的內標工作液。配置好的溶液置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 樣品處理

取待測血漿樣品50 μL，加入150 μL內標工作液（d4-LST-20 ng/mL+d4-LCA-25 ng/mL），混勻30 s，低溫離心5 min（13 000 r/min，8℃），取上清液100 μL，加稀釋劑1%甲酸水50 μL，混合均勻，進樣6 μL。

1.3.5 專屬性

取6個來源的空白血漿樣本、標準曲線最低管血漿樣本，除空白血漿以乙腈代替內標工作液外，其余均按1.3.4項下操作考察LST和LCA的專屬性。

1.3.6 標準曲線

將LST-LCA標準曲線系列工作液加入空白血漿中，得LST質量濃度為2.00，4.00，20.0，100，400，1 000，1 800，2 000 ng/mL，LCA質量濃度為2.40，4.80，24.0，120，480，1 200，2 160，2 400 ng/mL的LST-LCA血樣。按1.3.4項下處理后進樣分析，以待測物質量濃度x為橫坐標，待測物與內標的峰面積比值y為縱坐標，進行線性回歸得LST、LCA的標準曲線，權重系數(shù)為1/c2。

1.3.7 定量下限

以標準曲線的最低非零濃度點作為定量下限，配制濃度相當于標準曲線最低管，即LST血漿濃度為2.00 ng/mL、LCA血漿濃度為2.40 ng/mL的樣品，按1.3.4項下處理，連續(xù)進樣6次測定其濃度，計算其精密度與準確度。

1.3.8 基質效應

以純水為溶劑，配制LST質量濃度為3.00 ng/mL、LCA質量濃度為3.60 ng/mL的低濃度基質效應工作液與LST質量濃度為800 ng/mL、LCA質量濃度為960 ng/mL的高濃度基質效應工作液。取6個不同來源的空白血漿作為血漿基質，每一空白血漿6份（低、高濃度各3份），再取純化水6份作為對照基質，除稀釋劑1%甲酸水以相應基質效應工作液代替外，其余均按1.3.4項下處理，獲得LST、LCA和內標d4-LST、d4-LCA峰面積，根據(jù)每一濃度樣本2種基質中的峰面積比值計算基質效應。此外，配制脂血血漿（20%脂肪乳:空白血漿=1:9）、溶血血漿（凍融后全血:空白血漿=2:98），按以上相同方法考察脂血、溶血基質效應。

1.3.9 精密度與準確度

取用質控工作液加空白血漿配制的高、中、低、定量下限4個濃度質控血漿樣本，每個濃度6份，按1.3.4項下操作，測定3批，根據(jù)每批隨行標準曲線，計算每個樣品的實測濃度，并分析計算批內、批間精密度和準確度。根據(jù)SFDN《生物樣品定量分析方法驗證指導原則》，分析方法的精密度為測量值的相對標準偏差（變異系數(shù)），準確度為該方法測得值與分析物標示濃度的接近程度，表示為（測得值/真實值）×100%。

1.3.10 提取回收率

制備高、中、低3個濃度質控血漿樣本，每個濃度3份，按1.3.4項下操作，以其進樣得到的峰面積除以空白血漿經蛋白沉淀后，直接加入相應基質效應工作液后進樣得到的峰面積，計算血漿中LST、LCA及內標d4-LST、d4-LCA的提取回收率。

1.3.11 穩(wěn)定性

以純化水為溶劑，將相應儲備液、工作液配制成與標準曲線最高管進樣濃度一致的穩(wěn)定性考察工作液，分別進樣3次以考察儲備液、工作液短期保存穩(wěn)定性（室溫下保存22 h），儲備液長期保存穩(wěn)定性（–35℃冰凍保存117 d），工作液長期保存穩(wěn)定性（–35℃冰凍保存71 d）。

制備高、低2個濃度質控血漿樣本，各21份，按1.3.4項下操作，記錄色譜峰面積，由當日標準曲線計算其濃度，與未放置、儲存樣本比較，分別考察反復凍融穩(wěn)定性：–35 ℃反復凍融5次；室溫放置穩(wěn)定性：血漿樣本室溫（19.5℃）下放置8 h；上清液放置穩(wěn)定性：血漿樣本沉淀離心后，上清液室溫放置30 h；進樣室放置穩(wěn)定性：待測樣品于自動進樣器（8℃）放置16 h后進樣；重復進樣穩(wěn)定性：制備完成后的樣品重復進樣3次；長期保存穩(wěn)定性：–35℃、–80℃冰凍保存71 d；全血放置穩(wěn)定性：全血樣本在室溫條件下放置6 h。

2 結 果

2.1 專屬性

空白血漿按1.3.4項下操作進樣，得色譜圖見圖1（a），其本底值均低于300 cps，LST、LCA及其內標均無響應，標準曲線最低管血漿樣本按1.3.4項下操作進樣后得色譜圖見圖1（b），LST及內標d4-LST的保留時間為1.16 min，LCA及內標d4-LCA的保留時間為1.26 min?？瞻籽獫{中在LST、LCA保留時間處出峰面積均小于標準曲線最低管血漿樣本的20%，對應內標出峰位置均小于標準曲線最低管血樣的1%，兩組色譜圖對比可知空白血漿中的內源性物質不干擾LST和LCA的測定。

2.2 標準曲線

以待測物濃度x為橫坐標，待測物與內標的峰面積比值y為縱坐標，進行線性回歸得LST、LCA的標準曲線：LST：y=0.022 0x+0.005 53（r=0.999 2），LCA：y=0.012 4x+0.001 94（r=0.999 3），權重系數(shù)為1/c2（見圖2）。LST在2.00～2 000 ng/mL、LCA在2.40～2 400 ng/mL范圍標準曲線線性良好。

2.3 定量下限

標準曲線最低管濃度即定量下限，LST的血漿濃度為2.00 ng/mL，LCA血漿濃度為2.40 ng/mL。定量下限的考察結果中，LST的準確度為105.8%±0.1%，精密度（RSD）為3.8%，LCA的準確度為105.2%±0.1%，精密度（RSD）為5.4%。

2.4 基質效應

通過內標校準，血漿基質LST的低、高濃度基質效應分別為102.8%±3.8%、101.8%±0.9%，其RSD為3.7%、0.8%，LCA的低、高濃度基質效應分別為101.5%±2.7%、101.7%±0.4%，其RSD為2.7%、0.4%；溶血、脂血基質LST的低、高濃度基質效應分別為102.5%±0.4%、101.8%±0.3%，其RSD為0.4%、0.3%，LCA的低、高濃度基質效應分別為102.4%±0.1%、100.6%±0.1%，其RSD均為0.1%（見表1）。

2.5 精密度與準確度

如表1所示，LST每一濃度水平樣品的批內精密度RSD在1.6%～3.5%之間；批間精密度RSD在3.2%～5.3%之間；批內準確度在94.2%～105.2%之間，批間準確度在93.3%～106.6%之間。LCA每一濃度水平樣品的批內精密度RSD在1.3%～4.4%之間；批間精密度RSD在2.5%～4.8%之間；批內準確度在91.9%～101.0%之間，批間準確度在93.4%～99.5%之間。

圖1 UPLC-MS/MS法測定人血漿中LST、LCA及內標d4-LST、d4-LCA的典型色譜圖

圖2 UPLC-MS/MS法測定人血漿中LST、LCA濃度的標準曲線

表1 精密度和準確度、提取回收率結果

2.6 提取回收率

低、中、高3個濃度的質控樣品提取回收率，結果見表1，LST、LCA的提取回收率平均值分別為109.9%與97.55%。

2.7 穩(wěn)定性

儲備液、工作液的平均穩(wěn)定性及血漿樣本RSD均小于15%，符合相關要求，如表2、表3所示。

3 應 用

本文建立的方法已用于34例健康受試者在3個周期里餐后單次口服氯沙坦鉀片0.1 g的樣品測定，均值藥時曲線見圖3。由圖可知，試驗制劑與參比制劑餐后單次給藥LST、LCA的藥時曲線變化趨勢一致。代謝物LCA的達峰時間比藥物LST晚了約3 h，LST在服藥15 h后基本消除。此外，LST與LCA在吸收和分布向的標準偏差均較大，符合氯沙坦鉀作為高變異藥物的特點，與文獻[9-17]報道一致。

表2 儲備液、工作液的穩(wěn)定性考察結果（n=3）

表3 血漿樣本的穩(wěn)定性考察結果（n=3）

圖3 UPLC-MS/MS法測定人血漿中LST、LCA濃度的均值藥時曲線圖

4 討 論

在已有文獻報道的氯沙坦血藥濃度檢測方法中，Prasaja B等[18]采用了沉淀蛋白法，但其分析時間較長為3.5 min，血漿用量250 μL，氯沙坦線性范圍2～400 ng/mL，氯沙坦羧酸線性范圍1.85～370 ng/mL；王嫣然等[12]的研究分析時長2.5 min，但其前處理方法為相對麻煩的液液萃取法且血漿用量高達500 μL；方翼等[17]采用沉淀蛋白法，分析時長3 min，血漿用量50 μL，但其檢測的是健康受試者口服50 mg氯沙坦鉀片的血漿濃度。本試驗在以上研究方法的基礎上加以改進，以乙腈沉淀蛋白后甲酸水溶液稀釋進樣，對稀釋劑甲酸水的濃度進行了考察，配制比例為0.5%、0.75%、1%以及2%的甲酸水，結果顯示甲酸的濃度對峰寬及靈敏度有一定影響，當1%甲酸水作稀釋劑時峰形最優(yōu)、響應最高。試驗采用梯度洗脫，待樣本出峰后用98%乙腈沖洗色譜柱后再平衡進樣，每個樣本分析時間也僅需2.1 min，使基質效應降到最低，保證了樣本分析的重現(xiàn)性及穩(wěn)定性。

通常非極性和弱極性的化合物易獲得良好的峰形，而帶有－COOH、－NH2、－NHR、－NR2等極性基團的化合物則比較容易產生拖尾。由于氯沙坦及其代謝物氯沙坦羧酸的結構中均有含氮五元環(huán)、羥基和羧基等極性結構，本試驗在流動相中加入了適量的甲酸以改善峰形，對甲酸的濃度以及是否加入氨進行了考察。結果顯示，當流動相中僅含0.05%甲酸時，色譜峰易分叉，含0.15%甲酸時峰形改善，但在梯度沖洗有系統(tǒng)峰干擾測定，且LCA峰仍有拖尾現(xiàn)象，再加入0.04%氨后峰形達到最優(yōu)，且通過調整梯度無系統(tǒng)峰干擾。本試驗初期（夏天）流動相B相使用純乙腈，依次加入0.15%甲酸和0.04%氨時乙腈未出現(xiàn)白色結晶，在12月份測定樣本時發(fā)現(xiàn)B相有白色結晶析出，經分析甲酸銨在純乙腈中溶解性低，冬天室溫降低時容易析出，在純乙腈中加入2%純水（甲酸銨的良溶劑）即解決溶解性問題。

5 結束語

本研究采用同位素標記藥物為內標，建立了UPLC-MS/MS聯(lián)用技術，沉淀蛋白法同時測定人血漿中氯沙坦及其代謝物氯沙坦羧酸的血藥濃度。該方法血漿用量少（僅需50 μL），運行時間短（僅為2.1 min，含沖柱和平衡時間），線性范圍廣（LST：2.00～2 000 ng/mL，LCA：2.40～2 400 ng/mL），重現(xiàn)性好，適用于高通量的樣本分析工作，已成功應用于氯沙坦鉀片（0.1 g）在健康志愿者的生物等效性研究。