透明質酸靶向修飾苦參堿脂質體對肝癌H22小鼠的抑制作用*

趙玉璽，張世鵬，張 帆，劉 倪，劉 福

（川北醫學院，四川 南充 637000）

苦參堿（matrine，MA）是豆科植物苦參的干燥根、植株、果實經乙醇等有機溶劑提取制成的生物堿，屬四環喹嗪啶類化合物［1］，除有抗炎、抗病毒、抗肝纖維化、抗心律失常等作用外，還有較強的抗腫瘤作用，可抑制乳腺癌、肝癌、胃癌等多種腫瘤生長［2－5］。脂質體是由脂質雙分子層所形成的一種超微球形載體制劑，是納米載藥系統的典型代表［6］，常被用作抗腫瘤藥物的載體，以減輕被包裹藥物的毒性，或增加藥物的溶解性，或改變藥物的分布，提高藥物的生物利用度等，從而提高抗腫瘤效果。目前，已有很多種抗腫瘤藥物脂質體制劑被用于試驗和臨床研究［7］。透明質酸（hyaluronic acid，HA）是細胞外基質與胞間質的重要構成部分，其保證了細胞外基質結構。研究發現，透明質酸的特定受體包括受體CD44及RHAMM等，這些受體通常過量表達于腫瘤細胞表面，因此，透明質酸可作為腫瘤靶向藥物配體，實現主動靶向的目的。為增強苦參堿抗腫瘤作用，本試驗中制備了以透明質酸作為主動靶向配體修飾的苦參堿脂質體（HA－MA脂質體），篩選3種制備脂質體的方法后，再采用正交試驗法得出最佳處方，并對HA－MA脂質體在肝癌H22小鼠體內的抑瘤效果進行了驗證。

1 動物、儀器與試藥

實驗動物：SPF級雄性 BALB／c小鼠，體質量（20±2）g（北京維通利華實驗動物技術有限公司）；H22細胞株（川北醫學院基礎醫學院實驗室）。

儀器：SJIA－10N－50A型凍干機（寧波市雙嘉儀器有限公司）；DF－101S型集熱式磁力攪拌器（上海鵬鳴儀器有限公司）；RE－5003型旋轉蒸發儀（鞏義羽翔儀器廠）；ZS90型激光粒度分析儀（馬爾文公司）；DZ－C1000型超凈臺（丹澤科技有限公司）；DM－IL型倒置顯微鏡（德國徠卡公司）；5424型臺式離心機（艾本德儀器公司）；恒溫搖床（上海博訊有限公司）；100 μL 及1 000 μL 移液槍（德國 Brand 公司）。

試藥：苦參堿原料（西安中鑫生物技術有限公司，純度＞98%）；二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）、大豆磷脂、膽固醇、環磷酰胺（美國Sigma公司，純度＞99%）；透明質酸鈉（山東福瑞達生物化工有限公司，相對分子質量8 000 Da，純度＞98%）；其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 脂質體制備方法篩選［8］

乙醇注入法：分別稱取膽固醇 30 mg、卵磷脂120 mg，置燒瓶中，加入無水乙醇10 mL，超聲溶解，緩慢均勻注入60℃含苦參堿（含量為1 g／L）的磷酸鹽緩沖液（pH ＝7.4）3 mL 和含 HA －DOPE（含量為 1 g／L）的磷酸鹽緩沖液 2 mL，保溫攪拌 1.5 h，超聲 5 min，即得，編號為A。

薄膜分散法：分別稱取膽固醇 30 mg、卵磷脂120 mg、苦參堿5 mg，置燒瓶中，加入氯仿丙酮混合溶劑10 mL，于37℃旋轉蒸發除去溶劑，形成薄膜。加入pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液3 mL和含HA－DOPE（含量為 1 g ／L）的磷酸鹽緩沖液 2 mL，水化 1.5 h（35 ℃），即得，編號為B。

逆向蒸發法：分別稱取膽固醇30 mg、卵磷脂120 mg置茄形瓶中，加入氯仿10 mL及含苦參堿（含量為1 g／L）的磷酸鹽緩沖液5 mL，超聲5 min，形成穩定的水／油（W／O）相，35℃旋轉蒸發至凝膠狀，再加入2 mL含HA －DOPE（含量為 1 g／L）的磷酸鹽緩沖液，水化 1.5 h（35 ℃），即得，編號為 C。

將3種方法制得的HA－MA脂質體用蒸餾水稀釋后，再用激光粒度分析儀測定粒徑，結果脂質體A、脂質體 B、脂質體 C的平均粒徑分別為301.5，234.1，257.3nm，多分散系數（PDI）分別為 0.285，0.156，0.194。可見，以脂質體的多分散系數值和平均粒徑作為評價指標，采用薄膜分散法制備的HA－MA脂質體效果較好，故本試驗中選用薄膜分散法。

2.2 正交試驗法篩選處方

正交試驗：采用三因素三水平正交試驗表篩選制備HA－MA脂質體的最佳處方。三因素分別為磷脂比（因素A）、藥脂比（因素B）、磷酸鹽緩沖液的pH（因素C），詳見表1。采用離心法分離游離苦參堿和脂質體，采用高效液相色譜（HPLC）外標一點法測定HA－MA脂質體的包封率，篩選出最佳處方。正交試驗結果見表2。可見，三因素對包封率的影響程度依次為A＞B＞C，最佳處方為A1B2C2，即磷脂比為3∶1，藥脂比為1∶25，PBS 的 pH ＝7.4。

表1 因素水平表

表2 正交試驗結果

最佳處方工藝驗證：分6批按正交試驗篩選出的最佳工藝處方制備HA－MA脂質體，測定包封率。結果為（75.18 ± 1.26）%。

2.3 體外釋放試驗

分別取HA－MA脂質體、苦參堿脂質體（制備方法同HA－MA脂質體，在水化時加入5 mL pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液）5 mL以及苦參堿溶液（含MA 5 mg），置透析袋中，加入50 mL pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液作為釋放介質，振蕩溫度為37℃，轉速為100 r／min。分別在開始試驗的 0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，12.0，24.0，36.0，48.0 h時各取樣1 mL，用HPLC法測定苦參堿的藥物濃度，計算3組樣品在不同時間點累積釋藥分數，結果見圖1。可見，苦參堿在最初的0.5 h釋放已達70.72%，釋藥曲線在8.0 h后趨于穩定；而HA－MA脂質體和苦參堿脂質體無明顯突釋現象，8.0 h累積釋放度分別為58.83%和 55.78%；48.0 h時，HA －MA 脂質體和苦參堿脂質體的累積釋放度分別為88.32%和61.63%。因此，HA－MA脂質體和苦參堿脂質體的釋放曲線相似，且與游離藥物相比有一定緩釋作用。

2.4 HA－MA脂質體抑瘤試驗

用生理鹽水稀釋H22肝癌細胞株至適宜密度（2×106個 ／mL），接種于小鼠右腋窩皮下（接種量為0.2 mL／只）。將75只裸鼠分為腫瘤模型組、陽性對照組、MA組、MA脂質體組和HA－MA脂質體組，各15只（腫瘤模型組及MA組小鼠后各死亡1只，實際納入14只）。均于接種次日開始尾靜脈注射給藥，1次／日，連續給藥14 d。分別給予生理鹽水、環磷酰胺溶液（10 mg ／kg）、苦參堿溶液（10 mg ／kg）、苦參堿脂質體（苦參堿含量為10 mg／kg）、HA－MA脂質體（苦參堿含量為 10 mg ／kg），注射體積為每只 0.2 mL。

圖1 HA－MA的體外釋放曲線

給藥完畢處死小鼠，摘取腫瘤，稱量瘤體質量。按公式（抑瘤率＝1－治療組的平均瘤體質量／模型組的平均瘤體質量×100%）計算抑瘤率，用SPSS 18.0統計學軟件分析。由表3可知，苦參堿、苦參堿脂質體及HA－MA脂質體均可抑制腫瘤的生長，其中HA－MA脂質體的抑瘤率為59.60%，與陽性對照藥物環磷酰胺效果相近，均明顯高于苦參堿脂質體和苦參堿。結果表明，經過透明質酸修飾的苦參堿脂質體對H22肝癌小鼠腫瘤的抑制效果較明顯。

表3 5組藥物對H22肝癌小鼠的抑制作用

3 討論

隨著研究的深入，越來越多的中藥天然有效成分及其提取物被發現有助于治療腫瘤等疾病，且不良反應少，不易產生抗藥性［9］。苦參堿對多種腫瘤有抑制作用，其機制主要為抑制腫瘤細胞增殖和誘導分化、抗腫瘤細胞黏附和浸潤轉移。由于苦參堿的抗腫瘤作用機制極其復雜，特別是誘導分化與凋亡、抗血管新生的機制尚未清楚，因此，還需要大量的基礎和臨床研究，以進一步評估其有效性及聯合用藥的功效［10］。

本試驗中將苦參堿制備成脂質體，可達到緩釋、長效及被動靶向的目的，然而未經修飾的脂質體進入人體內主要被人體網狀內皮系統吞噬，有一定的系統靶向性，但器官靶向性差。透明質酸可通過與細胞表面透明質酸受體CD44和RHAMM結合，調節細胞的生長、增殖和遷移，尤其在腫瘤細胞的侵襲和轉移中發揮重要作用，其中CD44最重要，是與透明質酸結合的主要部位［11］。透明質酸具有良好的生物相容性、低免疫原性等優勢，作為藥物載體或靶向配體，近年來已成為治療腫瘤的研究熱點。透明質酸對脂質體進行表面修飾可提高脂質體的穩定性，減少脂質體被體內的網狀內皮系統吞噬，增加脂質體在人體血液中的循環時間，從而增強腫瘤靶向性［12］。

本試驗中通過制備方法比較和正交試驗，確定了HA－MA脂質體的制備方法和最佳處方，并通過體外釋放試驗證實其有緩釋作用。對H22肝癌小鼠的抑瘤試驗結果表明，HA－MA脂質體的抑瘤率與環磷酰胺效果相近，證實由于脂質體的包載及透明質酸配體的主動靶向作用，提高了苦參堿的生物利用度，增強了抗腫瘤效果，有望成為一種新型抗腫瘤靶向制劑。