臭靈丹抗K562和NB4細胞作用及黃酮成分研究*

韋孝晨，嚴 彪，徐乃玉，李啟潤，張 健

蘇州大學藥學院，江蘇 蘇州 215123

臭靈丹Laggera pterodonta(DC.)Benth.為菊科六棱菊屬植物，我國長江流域以及西南部地區均產，中國藥典及云南藥品標準均有收載；該藥在民間應用廣泛，具有抗菌、抗炎、鎮痛、祛痰、抗腫瘤的作用，主要用于治療上呼吸道感染、扁桃體炎、咽喉炎、口腔炎、支氣管炎、癰腫疥瘡等；臭靈丹的主要化學成分為洋艾素、金腰乙素等黃酮類、臭靈丹二醇、臭靈丹三醇等倍半萜類化合物［1］。本研究探討臭靈丹乙醇提取物(CLD)及其大孔樹脂95%乙醇洗脫部位(CLD-95)抗人白血病K562和NB4細胞的作用，以及乙醇提取物的黃酮類成分。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑Bruker AVⅢ-300、400型核磁共振儀；薄層層析硅膠和柱層析硅膠(200-300目，青島海洋化工廠)；ODS柱色譜填料(Daisogel公司)；凝膠 SephadexTMLH-20(GE healthcare Bio-science AB，Up-psala Sweden)；HF151UV 細胞培養箱(HealForceDevelopmentLtd.)；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；XDS-1A型倒置式生物顯微鏡(上海精密儀器儀表有限公司)；StatFax-2100型酶聯免疫檢測儀(美國Awareness)；MH-2型微量振蕩器(海門其林貝爾儀器制造有限公司)；KA-1000型臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；SZ-93型自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；Thermo Labsystems型移液槍(美國賽默飛世爾公司)；XB-K-25型細胞計數板(滬 02270113)；9LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海華線核子儀器有限公司)；RPMI1640(上海生物工程有限公司)；MTT(四甲基偶氮噻唑藍，美國Sigma公司)；細胞培養瓶(美國Corning公司)；96孔平底培養板(美國Corning公司)；Thermo Scintific酶標儀(美國賽默飛世爾公司)；Beckman細胞計數器(美國貝克曼庫爾特有限公司)。實驗細胞株K562和NB4均購自上海細胞所；AB-8大孔樹脂(河北滄州寶恩吸附材料科技有限公司)；所有分離試劑均為分析純，購于中國醫藥集團上?；瘜W試劑公司。藥材購于云南楚雄，經蘇州大學藥學院陸葉博士鑒定為臭靈丹全草。

1.2方法

1.2.1 化合物的提取分離 干燥臭靈丹全草500 g，用10倍量95%乙醇回流提取3次，2 h/次，提取液濃縮得乙醇提取物(CLD)119.5 g，溶于水中，石油醚萃取去除脂溶性雜質，得到水層45.0g，臭靈丹水層經AB-8大孔樹脂依次用水，50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脫，分別得到70%乙醇洗脫部分 7.2 g、95%乙醇洗脫部分(CLD-95)5.3g；95%乙醇洗脫部分再經Sephadex LH-20凝膠柱層析，用75%甲醇洗脫，洗脫成分經TLC檢識合并，得 到 化 合 物 1，2，3，4；70% 乙 醇 洗 脫 部 分 經Sephadex LH-20凝膠柱層析，甲醇洗脫，洗脫成分經TLC檢識合并，得到化合物5，6。

1.2.2 抑制K562和NB4細胞生長實驗

1.2.2.1 MTT實驗 取對數生長期K562和NB4細胞，調整細胞濃度至 1×104/mL，每孔 100 μL 種96孔板。RPMI 1640培養基稀釋臭靈丹乙醇提取物(CLD)與大孔樹脂95%乙醇洗脫部位(CLD-95)的儲存液，使終濃度為 12.5、25、50、100、200 μg/mL，每孔加入體積為100 μL。每個濃度4復孔。設空白孔(無細胞)，陰性對照孔和不同濃度給藥的細胞孔。培養24小時后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT，繼續培養4小時。1 200 r/min離心5分鐘，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，搖床震蕩10分鐘，酶標儀測492 nm處吸光值。實驗重復3次。細胞生長抑制率按以下公式計算：

1.2.2.2 FITC-Annexin-V/PI雙染法檢測細胞凋亡 取對數生長期的K562和NB4細胞，每孔2×105個，接種于 6 孔板，設空白孔(無細胞)，PI單染對照孔、Annexin-V單染對照孔和不同濃度藥物處理孔。RPMI 1640培養基稀釋臭靈丹黃酮部位儲存液，使終濃度為 12.5、25、50、100、200 μg/mL，每孔終體積為1.5 mL，培養24小時，4℃離心，1 200 rpm×5 min，收集細胞，預冷 PBS 于 4℃，1 200 rpm×5分鐘，洗滌1遍。每管加入100 μL 1×binding buffer、1 μLAnnexin-V FITC 抗體和1 μL PI，輕柔混勻，4℃避光靜置20分鐘。流式細胞儀檢測，數據由Cell Quest軟件分析處理。實驗重復3次。

1.3統計學方法采用SPSS 17.0統計軟件分析數據，計量資料以(±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1化合物的結構鑒定

2.1.1 化合物1 黃色粉末，1H-NMR(400 MHz，CDCl3)中，δ12.60(1H，s，OH-5)，7.72(1H，dd，J=2.2，8.6Hz，H-6′)，7.67(1H，d，J=2.2Hz，H-2′)，6.98(1H，d，J=8.6 Hz，H-5′)，6.50(1H，s，H-8)，3.96(3H，s)，3.96(3H，s)，3.95(3H，s)，3.91(3H，s)，3.85(3H，s)。以上數據與文獻［2］報道數據基本一致，故確定化合物為 5- 羥基 -3，6，7，3′，4′- 五甲氧基黃酮，即為洋艾素。

2.1.2 化合物2 黃色粉末，1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6) 中 ，δ7.67(1H，s，H-2′)，7.63(1H，d，J=8.4 Hz，H-6′)，6.96(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.68(1H，s，H-8)，3.92(3H，s)，3.88(3H，s)，3.81(3H，s)，3.74(3H，s)。以上數據與文獻［2］報道基本一致，因此確定化合物為4′，5-二羥基-3，6，7，3′- 四甲氧基黃酮，即為金腰乙素。

2.1.3 化合物3 黃色粉末，1H-NMR(400MHz，CDCl3)中，δ 12.64(1H，s，OH-5)，7.71(1H，d，J=1.9 Hz，H-2′)，7.68(1H，dd，J=1.9，8.4Hz，H-6′)，7.05(1H，d，J=8.4Hz，H-5′)，6.45(1H，d，J=2.2 Hz，H-8)，6.36(1H，d，J=2.2Hz，H-6)，6.00(1H，s，H-3)，3.99(3H，s)，3.88(3H，s)，3.86(3H，s)。以上數據與文獻［3］報道一致，因此確定化合物為 5- 羥基 -7，3′，4′- 三甲氧基黃酮。

2.1.4 化合物4 黃色粉末，在1H-NMR(400MHz，CDCl3) 中 ，δ12.61(1H，s，OH-5)，7.71(1H，dd，J=2.1，8.6Hz，H-6′)，7.67(1H，d，J=2.0Hz，H-2′)，6.97(1H，d，J=8.6 Hz，H-5′)，6.93(1H，d，J=2.2 Hz，H-8)，6.64(1H，d，J=2.2 Hz，H-6)，3.95(3H，s)，3.89(3H，s)，3.86(3H，s)，3.84(3H，s)。以上數據與文獻［4］報道一致，因此確定化合物為雷杜辛黃酮醇。

2.1.5 化合物5 黃色粉末，1H-NMR(300 MHz，DMSO-d6) 中 ，δ 12.96(1H，s，OH-5)，7.86(2H，d，J=8.8 Hz，H-2′，6′)，6.85(2H，d，J=8.8Hz，H-3′，5′)，6.66(1H，s，H-3)，6.74(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，6.45(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)，5.07(1H，d，J=7.2Hz glu H-1)，3.16-3.72(6H，m)，183.9(C-4)，165.2(C-2)，163.9(C-7)，162.3(C-5)，162.1(C-4′)，157.8(C-9)，129.5(C-2′，6′)，116.9(C-3′，5′)，122.0(C-1′)，106.3(C-10)，103.0(C-3)，99.5(C-6)，95.8(C-8)，100.8(glu C-1)，74.0(glu C-2)，77.1(glu C-3)，70.5(glu C-4)，77.3(glu C-5)，61.5(glu C-6)。以上數據與文獻［5］報道基本一致，因此確定化合物為芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

2.1.6 化合物6 黃色粉末，1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：12.48(1H，s，OH-5)，7.67(1H，d，J=2.0Hz，H-2′)，7.52(1H，dd，J=8.4，2.0Hz，H-6′)，6.87(1H，d，J=8.4Hz，H-5′)，6.41(1H，d，J=1.6Hz，H-8)，6.19(1H，d，J=1.6Hz，H-6)；化合物的 1H-NMR 與文獻［6］報道一致，故鑒定化合物6為槲皮素。

2.2對K 562和N B4細胞生長的抑制作用MTT法檢測發現CLD和CLD-95對K562和NB4細胞均有生長抑制作用，提示CLD和CLD-95均能抑制K562和NB4細胞增殖，并且具有明顯的濃度依賴關系。Annexin-V/PI雙染法測定結果提示CLD-95的濃度從 12.5～200 μg/mL，K562細胞和 NB4的凋亡率呈增加趨勢，表明CLD-95能誘導K562和NB4細胞的凋亡，并且有劑量依賴關系，隨著濃度的增加，誘導作用隨之增強，見圖1—3。

圖1 臭靈丹對K562和NB4細胞的抑制作用(n=5)

圖2 Annexin V/PI法檢測臭靈丹大孔樹脂95%乙醇洗脫部位K562細胞凋亡情況(24 h)

圖3 Annexin V/PI法檢測臭靈丹大孔樹脂95%乙醇洗脫部位NB4細胞凋亡情況(24 h)

3 討論

相關文獻［7］報道臭靈丹水煎液對急性淋巴細胞型白血病、急性粒細胞型白血病及急性單核細胞型白血病患者的血細胞脫氫酶有較強的抑制作用。臭靈丹中 3，5- 二羥基 -6，7，3′，4′- 四甲氧基黃酮(HTMF)顯著抑制Hep-2細胞的增殖并呈濃度、時間雙重依賴性關系［8］。MTT研究結果顯示，臭靈丹的乙醇提取物與大孔樹脂的95%乙醇洗脫部位均有抑制人白血病K562和NB4細胞的作用，大孔樹脂的95%乙醇洗脫部位較乙醇提取物的活性強，推測大孔樹脂95%乙醇洗脫部位可能是臭靈丹抗白血病的主要活性部位，其化學成分主要為黃酮類成分，并且從中分離得到4個黃酮苷元。Annexin V/PI雙染流式細胞術檢測法主要檢測細胞的早期凋亡，大孔樹脂95%乙醇洗脫部位作用24小時后，在一定濃度內，大孔樹脂的95%乙醇洗脫部位通過誘導K562和NB4細胞凋亡而發揮抑制作用，并呈量效關系。本研究結果為進一步確定臭靈丹抗白血病藥理機制及其活性成分奠定了基礎。