丹參注射液對兔軟骨細胞增殖與凋亡的影響*

段洪超，王慶超，張 杰黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150009

骨性關節炎(osteoarthritis，OA)是一種關節軟骨退行性骨關節疾病，被稱為老年性關節炎、增生性關節炎、退行性關節炎、骨關節病、肥大性關節炎等，是中老年人常見的進展性骨關節疾病。臨床表現為功能障礙、疼痛。重癥患者表現為關節殘廢，比如髖、膝及脊柱等的殘廢［1］。在我國OA的致殘率為51%［2-3］，嚴重影響患者的生活質量，成為醫學研究的熱點。有文獻報道［4-5］丹參注射液能有效降低實驗性兔模型關節液中白細胞介素1及腫瘤壞死因子的水平，且兔膝軟骨細胞破壞程度明顯低于造模組，表明丹參關節內注射能有效治療OA。柯青等［6］發現丹參注射液在治療膝關節骨性關節炎方面取得和透明質酸鈉類似的療效，而且還可大幅度提高患者的生活質量。本研究從分子生物學角度探討丹參注射液促進OA軟骨細胞修復的機制，為臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物健康4周齡雄性新西蘭大白兔24 只，體質量(1.2±0.1)kg，平均 1.2 kg，由黑龍江中醫藥大學GLP中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(黑)2013-004，實驗動物使用許可證號：SYXK(黑)2013-012。

1.2藥物丹參注射液(正大青春寶制藥，批號：1704133，規格：10 mL/ 支)；DMEM 培養基(武漢普諾賽Procell生命科技有限公司)；胎牛血清(Amresco公司)；Ⅱ型膠原酶(Invitrogen公司)；胰蛋白酶(上海書吉生物科技有限公司)；甲苯胺藍(上海紫一試劑廠)；MTT(四甲基偶氮噻唑藍，北京華越洋生物科技有限公司)；cDNA第一鏈合成試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)；丙烯酰胺(鄭州鴻祥化工有限公司)；甲叉雙丙烯酰胺(大連美侖生物科技有限公司)；引物合成(武漢金開瑞生物工程有限公司)；磷酸酶抑制劑(上海朝瑞生物科技有限公司)；RIPA裂解液(上海威奧生物科技有限公司)；兔抗GAPDH 37KD(北京中杉生物科技有限公司)；HRP標記羊抗兔二抗，兔抗p-erk 42、44KD，兔抗p-p38 43KD(均購自上海科興生化試劑有限公司)。

1.3儀器5424小型高速離心機(Eppendorf中國有限公司)；utrao-SM 800全自動酶標儀(上海永創醫療器械有限公司)；SLAN-96P型實時熒光定量PCR儀(上海宏石醫療科技有限公司)；MPK5000電轉儀(上海智巖科學儀器有限公司)；My Cycler型PCR儀(伯樂生命醫學產品有限公司)；ZF-6型紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)；Bio Spectrometer分光光度計(艾本德中國有限公司)；HE-120型水平電泳儀(上海實生細胞生物技術有限公司)；DHG-9030A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海之信儀器有限公司)；CQT-191IR型CO2恒溫培養箱(蘇州珀西瓦爾實驗設備有限公司)；PC500型流式細胞儀(貝克曼庫爾特公司)；ZD-9556型水平搖床(金壇盛藍儀器制造有限公司)。

1.4實驗方法

1.4.1 兔軟骨細胞培養與鑒定

1.4.1.1 兔軟骨細胞的分離與培養 1)將空氣栓塞注入兔耳緣靜脈，處死后消毒。2)無菌條件下切取股骨髁和脛骨平臺關節軟骨，PBS緩沖液漂洗3次，剪成1 mm大小，PBS重復漂洗，剪碎的軟骨放置于離心管內，加PBS緩沖液，靜止后棄上清液，加2 mL質量分數為0.25%胰蛋白酶,37℃條件下消化30分鐘。加入2 mL DMEM培養基Ⅰ，3 000 r/min離心3分鐘，棄去上清液，加入4 mL混合消化液，37℃消化至第2天。加入等量DMEM培養基Ⅰ，吹打均勻。3 000 r/min離心5分鐘，加入DMEM培養基Ⅱ重懸細胞沉淀，接種到無菌培養皿中，置于CO2培養箱中培養，48小時后根據細胞貼壁情況，每3天更換培養液1次。使用倒置顯微鏡觀察軟骨細胞生長情況，等細胞匯合成片，分布在大部分培養皿，細胞密度大約80%左右，棄培養液，PBS漂洗1次，加1～2 mL質量分數為0.25%胰蛋白酶消化細胞。顯微鏡下，消化1～2分鐘，觀察可見細胞相互分離變圓，消化完成后，棄胰酶溶液，加培養基，制成單細胞懸液，按1∶3的比例傳代，飽和濕度條件下擴大培養。

1.4.1.2 細胞的鑒定 通過甲苯胺藍染色法鑒定軟骨細胞。將已分布細胞的玻片用PBS溶液漂洗3次，3 min/次；用4%的多聚甲醛固定玻片15分鐘，用PBS溶液漂洗3次，3 min/次；入水浴鍋預熱60℃，使用甲苯胺藍染液染色30分鐘，雙蒸水洗3次；95%乙醇分化，脫色，顯微鏡下背景清楚即可；100%酒精脫水，二甲苯透明，置于通風櫥條件下，干燥后中性樹膠封片；鏡下觀察細胞結構。1.4.2 MTT法檢測2～5代細胞增殖曲線 取良好生長的第2～5代軟骨細胞，接種于96孔板中，取濃度為10%胎牛血清(FBS)的DMEM溶液培養24小時；通過無FBS的DMEM溶液培養24小時消化軟骨細胞，加濃度為10%FBS的DMEM溶液培養，每代細胞設定為6孔，分別于第1～10天；棄去培養溶液，使用PBS溶液10 μL漂洗1次，每孔加入濃度為0.5%MTT溶液20 μL，37℃孵育4小時，棄去MTT溶液，使用PBS溶液10 μL漂洗1次，加入體積為200 μL的二甲基亞砜(DMSO)溶液，37℃振蕩10分鐘；設定酶標儀波長570 nm，檢測OD值，記錄數據，繪制第2～5代細胞的生長曲線。

1.4.3 建立細胞活性的時效及量效關系

1.4.3.1 梯度時間法優化丹參注射液干預軟骨細胞活性的時效關系 取良好生長的第3代軟骨細胞，接種于96孔板中，取濃度為10%FBS的DMEM溶液培養24小時；加入含丹參注射液終濃度為0、50 μg/L含10%FBS的DMEM溶液中培養，每組細胞設定為6孔，培養24小時、48小時、72小時、96小時。棄去培養基，使用PBS溶液10 μL漂洗1次，每孔加入濃度為0.5%MTT溶液20 μL，37℃孵育4小時，棄去MTT溶液，使用PBS溶液10 μL漂洗 1 次，加入體積為 200 μL的 DMSO溶液，37℃振蕩10分鐘，使結晶溶解。設定酶標儀波長570 nm，檢測OD值，記錄數據，找到丹參注射液對軟骨細胞活性的時效關系。

1.4.3.2 梯度濃度法優化丹參注射液干預軟骨細胞活性的量效關系 取良好生長的第3代軟骨細胞，接種于96孔板中，取濃度為10%FBS的DMEM溶液培養24小時；加入含丹參注射液終濃度為0、25、50、100、200、400 μg/L含 10%FBS 的 DMEM 溶液中培養，每組細胞設定為6孔，培養72小時。棄去培養基，使用PBS溶液10 μL漂洗1次，每孔加入濃度為0.5%MTT溶液20 μL，37℃孵育4小時，棄去MTT溶液，使用PBS溶液10 μL漂洗1次，加入體積為200 μL的DMSO溶液，37℃振蕩10分鐘，使結晶溶解。設定酶標儀波長570 nm，檢測OD值，記錄數據，找到丹參注射液對軟骨細胞活性的量效關系。

1.4.4 RT-PCR法檢測各組軟骨細胞Bcl-2、Bax的表達

1.4.4.1 T-RNA的提取 第3代軟骨細胞→加1mL Trizol溶液反復吹打→轉入1.5 mLEP管中→顛倒混勻5次，放置5分鐘→加三氯甲烷200 μL，顛倒混勻10次，放置15分鐘→4℃條件下，12 000 r/min離心15分鐘，管內分4層→轉上層水相(約500 μL)于1.5 mL EP管中→加入等體積異丙醇(約500 μL)，顛倒混勻10次，放置10分鐘→4℃條件下，12 000 r/min離心10分鐘，棄上清液，可見貼壁薄層及白色的RNA→加75%乙醇1 mL→4℃條件下，7 500 r/min離心5分鐘，棄上清液，干燥10分鐘→加20 μL純凈水溶解RNA→核酸蛋白檢測儀驗證抽取是否成功→逆轉錄成cDNA。

1.4.4.2 逆轉錄反應 逆轉錄反應體系及條件見表1—2。

表1 逆轉錄反應體系

表2 逆轉錄反應條件

1.4.4.3 引物的設計與合成 查詢新西蘭兔相關基因序列，輸入引物設計軟件設計上、下游引物序列，將其進行對比，上、下游引物匹配率均為100%。

1.4.4.4 PCR反應 PCR反應體系及條件見表3—4。

表3 PCR反應體系

1.5統計學方法采用SPSS 13.0統計學軟件處理數據，計量資料以(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，同組干預前后采用配對t檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1第2～5代細胞的增殖曲線第1天各代細胞OD值沒有顯著差異(P＞0.05)，第2天增殖緩慢，第3天逐漸加快增殖，第4天進入生長期，第5、6天增殖變慢，第7、8天增殖進入平臺期，第9、10天增殖抑制。OD值隨細胞傳代呈減低趨勢，第2、3 代高于第 4、5 代，但沒有顯著差異(P＞0.05)，見圖1。

圖1 各組軟骨細胞增殖曲線

2.2優化丹參注射液干預細胞活性的時效關系2組干預24小時OD值沒有顯著差異(P＞0.05)，干預48小時OD值中劑量組大于對照組(P＜0.05)，干預72、96小時OD值中劑量組明顯大于對照組(P＜0.01)，中劑量組干預72小時OD值顯著大于24、48、96小時(P＜0.05)，故選擇細胞干預72小時作為以后實驗檢測時間點，見表5。

表5 梯度時間法優化丹參注射液干預軟骨細胞活性的時效關系(±s)

表5 梯度時間法優化丹參注射液干預軟骨細胞活性的時效關系(±s)

注：與對照組相比，＊表示P＜0.01，□表示P＜0.05；與同組干預前比較，△表示P＜0.05，#表示P＜0.01

組別 干預前 干預后24 h 干預后48 h 干預后72 h 干預后96 h對照組 0.19±0.03 0.27±0.02△ 0.38±0.03△ 0.51±0.04# 0.48±0.03#中劑量組 0.20±0.02 0.29±0.02△ 0.39±0.02□△ 0.57±0.02＊# 0.51±0.03＊#

2.3優化丹參注射液干預細胞活性的量效關系第3代軟骨細胞用不同丹參注射液終濃度的10%FBS DMEM溶液干預，干預前細胞OD值沒有明顯差異(P＞0.05)；干預 72 小時候后，400、200、100、50、25 μg/L濃度細胞的OD值顯著大于0 μg/L濃度OD 值(P＜0.01)；50 μg/L濃度細胞 OD 值顯著大于400、200、100、25 μg/L 濃度OD 值(P＜0.01)；100 μg/L濃度的細胞 OD值顯著大于 400、200、25μg/L濃度OD 值(P＜0.01)；100 μg/L濃度細胞OD值與50μg/L濃度細胞OD值比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表6。

表6 梯度時間法優化丹參注射液干預軟骨細胞活性的量效關系(±s)

表6 梯度時間法優化丹參注射液干預軟骨細胞活性的量效關系(±s)

濃度/(μg·L-1) 干預前 干預后0 0.19±0.02 0.47±0.03 25 0.20±0.03 0.49±0.03 50 0.18±0.02 0.56±0.03 100 0.20±0.02 0.57±0.02 200 0.19±0.03 0.53±0.02 400 0.21±0.02 0.50±0.03

2.4RT-PCR檢測細胞Bcl-2、Bax的表達誘導凋亡的第3代軟骨細胞，加丹參注射液干預24小時后細胞Bax表達中、高劑量組小于模型組(P＜0.05)，高劑量組小于低劑量組(P＜0.05)；細胞Bcl-2表達中、高劑量組大于模型組(P＜0.05)，高劑量組大于低劑量組(P＜0.05)，見表7。

表7 丹參注射液干預后細胞Bcl-2、Bax的表達(±s)

表7 丹參注射液干預后細胞Bcl-2、Bax的表達(±s)

注：與模型組比較，■表示P＜0.01，□表示P＜0.05；與低劑量組比較，▲表示P＜0.01，△表示P＜0.05

組別 Bcl-2 Bax正常組 2.697±0.532△■▄ 1.135±0.793▲模型組 0.908±0.259 6.674±1.257低劑量組 1.723±0.451 6.108±1.982中劑量組 2.239±0.564□ 4.170±2.134□高劑量組 3.134±0.702□■ 2.458±0.675□■

3 討論

OA是一種關節軟骨降解進展性疾病，其主要病理變化由軟骨細胞分解、合成活動失衡導致。軟骨細胞屬于終末分化細胞，其在體外的傳代培養過程中出現增殖停滯，表型喪失，呈老化狀態，這種老化屬于復制性老化。細胞老化是細胞周期調控下多基因參與的復雜的生理病理過程，具有一定可控性。細胞周期調控因子相互作用導致細胞老化［7-8］。有研究［9］證明關節軟骨細胞的凋亡與細胞周期調控因子Bcl-2等活性密切相關，軟骨細胞凋亡過盛可能使關節軟骨退變發展成骨關節炎。

祖國醫學認為骨性關節炎屬“骨痹”范疇。中醫對其認識和治療有悠久的歷史。《素問·痹論篇》曰：風寒濕三氣雜至,合而為痹也。歷代醫家又從實踐中不斷加以發展。王清任《醫林改錯》一書提出“痹由瘀血致病”說，書中列有身痛逐瘀湯等方劑,治療別具一格。丹參味苦性微寒，歸心、肝經，功能活血通絡，《日華子本草》曰：“通利關脈，治……骨節疼痛，四肢不遂。”《本草正義》言：“專入血分,其功在活血行血，內之達臟腑而化瘀滯，故積聚消而瘕破，外之利關節而通經絡，則腰健而痹著行。”現代醫學研究［10］發現其有效成分丹參酮對炎癥有良好的治療作用，且可抗氧化，改善微循環；丹參注射液關節內注射可有效減輕關節軟骨損傷及退行性改變［11］；還可保護軟骨細胞，防止關節軟骨退變［12］。

本研究結果表明丹參注射液可修復退變軟骨，防治骨性關節炎，該作用與減少軟骨細胞凋亡密切相關，機制可能是：上調抗凋亡調控因子Bcl-2的表達，下調促凋亡調控因子bax的表達，從而減少軟骨細胞凋亡，丹參注射液的調控效果與其濃度有一定關系。今后應設計大樣本、雙盲、隨機對照試驗，結合現代醫學方法，深層次探討丹參注射液對骨性關節炎治療作用的機制。