探討用分型方法檢測溯源副溶血性弧菌

李玉 徐艷霞 句立言 孫紅 潘玉輝 孫婷媛

副溶血性弧菌（VP）是在被污染或者攜帶傳播疾病食品中存在的病原菌，和食品安全具有緊密的聯(lián)系，因此政府和社會對其比較關(guān)注[1-2]。溯源是對病原菌的來源，親緣關(guān)系等進(jìn)行分析，對流行性進(jìn)行預(yù)測，提前進(jìn)行防控的手段。此次我們對血清分型、PFGE和ERIC-PCR等方式的分型情況開展了分析研究。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

此次收集了食品來源VP607株，患者和食物中毒VP480株，對這些菌株進(jìn)行了血清分型，并采取了PFGE基因分析和ERIC基因分析，對感染源追蹤，了解其溯源和親緣關(guān)系等情況。

1.2 方法

參照美國PulseNet PFGE標(biāo)準(zhǔn)化方法[3-4]，（1）制膠塊：2 ml細(xì)胞懸浮液（CSB），挑取新鮮培養(yǎng)物，均勻懸濁，使菌液濁度至20%透射值。將混合物加入模具孔中制成膠塊，4℃ 10 min冷卻。（2）蛋白消化：3 ml細(xì)胞裂解液（CLB）溶液加入15 μl蛋白酶K（20 mg/ml）（最終濃度0.1 mg/ml），用模具梳子將膠塊直接取出，投入CLB中54℃水浴2 h。棄液，涼至室溫，加3 ml TE，置4℃保存。（3）酶切。（4）制膠：將酶切后的樣品膠置于樣品梳上，擺放到模具上。（5）電泳：電壓6 V/cm，電泳時間19 h，脈沖參數(shù)（2～10 s，13 h）：（20～25 s，6 h），電泳溫度14℃。（6）染色：電泳結(jié)束后，將凝膠取出，用0.5 μg/ml的Goldview染色30 min，去離子水脫色30 min。（7）讀膠：用凝膠成像儀讀膠分析。

2 結(jié)果

來自食品來源的607株菌株共分成了10個血清群，有30株無法分型的海產(chǎn)品分離株VP，這可能是新的血清群，分型率是94.64%，0：6群和0：5群為流行優(yōu)勢株；來自患者和食物中毒的480株菌株分成了6個血清群，0：3群為流行優(yōu)勢株。海產(chǎn)品VP分成了PFGE型29個，患者和食物中毒菌株P(guān)FGE型為12個。261株不同來源的VP分出42個ERIC基因型。有141株是海產(chǎn)品中的，有60例株是腹瀉患者的，食品和環(huán)境VP的ERIC-PCR多態(tài)性電泳條帶。

3 討論

VP菌株血清分型和許多的胃腸道急性疾病有緊密聯(lián)系[5-6]，VP是上世紀(jì)末在世界范圍內(nèi)流行的優(yōu)勢菌株，在現(xiàn)今社會也有很高的流行度，其感染和蔓延能力受到了廣泛的關(guān)注。海產(chǎn)品分離VP優(yōu)勢株和患者分離優(yōu)勢株存在差異性，致病風(fēng)險情況還有待實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。海產(chǎn)品有可能導(dǎo)致VP食品源的爆發(fā)和擴(kuò)散，需要引起我們的關(guān)注。此次研究有30株無法分型的海產(chǎn)品分離株VP，這可能是新的血清群。表明VP血清分型具有局限性。

PFGE分型由Schwarts和Cernter建立，通過改變電場方向來分析DNA分子[7-8]。分型過程需要對細(xì)菌染色體結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測，其準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性高，對菌株微小差異能夠顯示。此次研究中我們認(rèn)為海產(chǎn)品分離株VP大部分都不會導(dǎo)致食物中毒和腹瀉。

ERIC-PCR分型是通過腸桿菌科和弧菌屬細(xì)菌的短重復(fù)序列在不同菌種上的差異性進(jìn)行分析。ERIC-PCR是對細(xì)菌基因分型比較有效的方式，對菌株的親緣關(guān)系和溯源具有優(yōu)勢。可以研究菌株間致病能力的關(guān)聯(lián)性。

總而言之，三種分型方式對于VP分型都有效果，各有特點(diǎn)。血清分型能夠?qū)P流行優(yōu)勢型進(jìn)行溯源，但分辨率低，費(fèi)時，復(fù)雜，對菌株關(guān)系無法確定，無法溯源。PFGE和ERIC-PCR對VP進(jìn)行有效分型，也能夠確定菌株間的親緣關(guān)系，對致病性相關(guān)性研究有幫助。推介兩種或多種分型方式共同使用，可以更快更準(zhǔn)確的進(jìn)行分型，防控VP導(dǎo)致的腹瀉和食物感染事件。

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