Treg細胞在大鼠肝移植術后感染免疫紊亂中的作用

楊 宇 曲義坤 丁 隆 趙 勇 李艷君 陳立強 孫 權

(佳木斯大學基礎醫學院局部解剖學教研室，黑龍江 佳木斯 154007)

感染是肝移植術后最常見的并發癥,亦是移植病人術后死亡的主要原因之一，包括病毒、細菌、真菌的感染。然而，在肝移植受者中大部分嚴重感染源自腹腔內細菌或真菌感染，而且發生率高，為35%～70%，半數患者感染發生在移植術后2 w內。在臨床實際治療中，發生細菌感染的病人，免疫抑制藥物的應用與抗感染治療產生了矛盾，這時為搶救病人的生命，往往需要減量或停用免疫抑制藥物，而這對移植肝臟的影響尚不得而知。研究〔1〕指出，當發生重癥感染時，機體為保護組織器官的過度病理性損害，激發免疫反應的同時，也可能啟動了免疫抑制效應。在眾多因素中，CD4+CD25+調節性T細胞(Treg)的表達變化引起了廣泛關注，它能夠分泌免疫抑制因子白細胞介素(IL)-10和腫瘤壞死因子(TGF)-β，并通過這兩種細胞因子發揮較強的免疫抑制效應；而且Treg細胞能夠抑制免疫排斥反應和移植物抗宿主病(GVHD)的發生。可見感染和免疫排斥反應誘導了Treg細胞的增殖和Th細胞分化，然而并不是所有增殖的Treg都能表達調節性T細胞轉錄調節因子(Foxp)3基因，因此通過給予不同的單克隆抗體，可以驗證在這種免疫紊亂中Treg是否發揮了免疫學效應，本研究探討Treg在大鼠肝移植術后感染免疫紊亂中的作用。

1 資料與方法

1.1實驗分組 以DA大鼠為供體，LEW大鼠為受體，術后分為4組，每組30只：急性排斥(G1)組、移植后腹腔感染(G2)組、在G2組處理的基礎上于術后第2天始加用anti-IL-10和anti-TGF-β單克隆抗體(G3)組，注射量分別為：1.2 mg·kg-1·d-1和0.9 mg·kg-1·d-1，G4組：在G3組處理的基礎上于術后第2天開始加用anti-CD25單克隆抗體，注射量為1.0 mg·kg-1·d-1。每組設感染前1 d、感染后1、3、5、7 d 5 個時相點，每個時相點6 只大鼠。

1.2檢測指標 分別采用流式細胞術、單向混合淋巴細胞培養、逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術測定外周血淋巴細胞亞群、淋巴細胞功能、肝臟內IL-4、干擾素(IFN)-γ、IL-10、TGF-β mRNA。

1.3統計學方法 應用SAS6.0軟件進行方差分析、t檢驗、Kaplan-Meier曲線及對數秩檢驗(Log-Rank)。

2 結 果

2.1大鼠生存狀態觀察 G1組術后精神狀態尚可，6 d后出現鞏膜黃染，體重逐漸下降，食欲活動均下降，多于術后13 d左右死亡。G2組感染后5 d部分出現少量口鼻出血，嗜睡狀態，并有死亡鼠，感染后7 d生存率為37.5%，最長生存8 d。G3、G4組感染后鞏膜漸進性黃染，口鼻、眼角不同程度出血，體重下降，體溫升高，活動減少，生存時間縮短，感染后7 d生存率為只有25%。

2.2外周血淋巴細胞亞群(CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)的變化 各組淋巴細胞亞群數量在感染后不斷下降。在感染后5 d CD4+、CD8+在G3、G4組的數量與G1、G2組比較差異均有統計學意義(P<0.05,P<0.01)；感染后CD4+/CD8+比值回升，在G3組感染后5 d CD4+/CD8+比值變化顯著，與G1、G4組差異均有統計學意義(P<0.01)，G4組CD4+/CD8+比值回升雖不及G3組顯著，但在感染后3 d各時間點與G2、G1組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.3外周血淋巴細胞功能的改變 隨術后(感染后)時間的增長，各組淋巴細胞功能持續上升。G3組升高更顯著，G3、G4組在感染后3、5、7 d與G1組相比差異有統計學意義(P<0.05,P<0.01)。G3與G4組僅在感染后3 d和7 d比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.4各組肝內IL-4、IFN-γ、IL-10、TGF-β mRNA的表達水平 G2、G3、G4組IL-4 mRNA表達水平持續上升(P<0.05)，與G2組比較，G3、G4組的表達水平自感染后各時間點差異均有統計學意義(P<0.05,P<0.01)，見表3。G1、G3、G4組IFN-γ mRNA的表達水平均逐漸增加(P<0.05)，G3組變化顯著。G3、G4組自感染后各時間點與G2組比較差異均有統計學意義(P<0.01)。見表4。IL-10、TGF-β mRNA表達含量在G3組的表達水平極低，與各組比較差異均有統計學意義(P<0.05,P<0.01)；在G4組表達持續下降，術后各時間點與其他三組比較差異均有統計學意義(P<0.01)。G1、G3、G4組隨著術后(感染后)時間增長，IL-10、TGF-β mRNA表達逐漸下降，G2組逐漸升高，見表5，表6。

表1 各組術后(感染后)不同時間點淋巴細胞亞群變化

與前一時間點比較：1)P<0.01；與G1組比較：2)P<0.01；與G2組比較：3)P<0.05；與G3組比較：4)P<0.05

表2 各組術后(感染后)不同時間點淋巴細胞功能的變化

與前一時間點相比：1)P<0.05；與G1組相比：2)P<0.05,3)P<0.01；與G3組比較：4)P<0.05；表3同

表3 各組術后(感染后)不同時間點肝臟內IL-4 mRNA表達含量的變化

表4 各組術后(感染后)不同時間點肝臟IFN-γ mRNA的表達水平變化

與前一時間點比較：1)P<0.05；與G2組比較：2)P<0.01

表5 各組術后(感染后)不同時間點肝臟內IL-10 mRNA表達含量的變化

與G3組比較：1)P<0.05,2)P<0.01；與G4組比較：3)P<0.01；與前一時間點比較：4)P<0.05,5)P<0.01，表6同

表6 各組術后(感染后)不同時間點肝臟TGF-β mRNA的表達水平變化

3 討 論

感染性疾病往往伴隨著炎癥及組織損傷，因此抗原提呈細胞(APC)遞呈的抗原不僅有病原體抗原，也有自身抗原，機體為調節這種免疫效應，在激活效應T細胞的同時也激活了Treg，防止過度的組織損傷。CD4+CD25+T細胞的激活雖然對機體起到了一定的保護作用，但同時也抑制了機體對病原微生物的清除，致使慢性炎癥發生，嚴重的還可能引發致命性的感染。Stoop等〔2〕研究指出，感染單純皰疹病毒的小鼠體內可以分離到大量的CD4+CD25+T細胞，用anti-CD25抗體拮抗CD25分子，則可提高機體的抗病毒能力。類似的結果在對慢性乙型或丙型肝炎病人的研究中也得到證實，并且通過體外實驗研究表明，CD4+CD25+T細胞明顯抑制了抗病毒的特異性效應T細胞的功能〔3～6〕。Belkaid等〔7,8〕研究小鼠真皮利什曼原蟲感染時發現，在感染部位，CD4+T細胞和CD4+CD25+T細胞均有增殖。體外的實驗〔8〕結果證實，CD4+CD25+T細胞借助于IL-10發揮抑制效應，若用anti-CD25抗體預處理則可提高機體對利什曼原蟲的清除。

本研究說明抗體的應用阻抗了Treg細胞對淋巴細胞功能的抑制作用，而anti-IL-10/TGF-β單克隆抗體能更有效地阻止已發生的免疫抑制作用。

Treg不僅能誘導移植免疫耐受，同時也能阻止GVHD的發生。Cohen等〔8〕在研究Treg在造血干細胞移植中作用時發現，少量(3%～5%)的Treg即能抑制GVHD的發生，如果將這部分Treg剔除，則加速了疾病的發生；相反，若輸注新鮮分離的Treg則可延緩GVHD的發生。Johnson等〔9〕、Hoffman等〔10〕也通過不同的實驗方法直接或間接證明了Treg在抑制GVHD中發揮了重要作用。

從本研究結果看出，抑制Treg的增殖部分恢復了肝移植術后細菌感染引起的免疫抑制作用；而應用anti-IL-10/TGF-β單克隆抗體其作用高于應用anti-CD25單克隆抗體的原因，分析為：Treg雖然依賴于IL-10和TGF-β發揮作用，但Treg不是唯一能分泌IL-10和TGF-β的細胞，內皮細胞、巨噬細胞、Th2細胞具有同樣的作用；而本研究結果也發現，抑制Treg促進了Th2細胞的分化，大鼠體內IL-10 mRNA的表達雖然下降，但并沒有完全被阻遏，而這部分因子尚能發揮免疫抑制作用。

綜上，抑制Treg的增殖部分恢復了淋巴細胞的功能；抑制Treg的增殖，減少了體內IL-10和TGF-β mRNA的表達水平；Th細胞的分化不是Treg作用的結果，但后者可以部分地抑制前者的分化。