桂枝茯苓丸對腦缺血再灌注損傷大鼠TNF-α和ET-1水平的影響

孫 勇 張 園 邢 影

(吉林大學中日聯誼醫院神經內科，吉林 長春 130033)

腦梗死(CI)是由于腦動脈的急性閉塞導致腦組織缺血、缺氧的急性神經系統疾病。目前臨床上最為有效的治療手段為盡早恢復大腦血流，改善腦組織缺血、缺氧。然而，當大腦血氧供應恢復后，缺血再灌注(I/R)使得腦損傷進一步加重。因此，盡早有效地改善閉塞血管血流，并降低I/R所致的進一步損傷，阻止缺血性腦卒中的進展亟待解決。桂枝茯苓丸最初應用于婦科疾病，但近幾年一些研究發現，桂枝茯苓丸在治療CI方面具有重要作用〔1，2〕，本研究在制備腦I/R大鼠模型基礎上，檢測大鼠血清及腦組織中腫瘤壞死因子(TNF)-α、內皮素(ET)-1含量變化，并通過超聲觀察頸動脈的血流情況，為桂枝茯苓丸的腦保護提供實驗及理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料 選用健康清潔型大鼠90只(遼寧長生生物技術股份有限公司提供，許可證號：SCKK(遼)2015-0001)；桂枝茯苓丸(吉林天強制藥)；試劑：TNF-α酶聯免疫試劑盒和ET-1放射免疫試劑盒(上海酶聯生物)； 儀器：彩色多普勒超聲儀(型號LOGIQ7型，美國GE公司)。

1.2I/R大鼠模型的制備 250～300 g雄性Wistar大鼠，術前1 d禁食水，次日清晨10%水合氯醛腹腔注射(0.4 ml/100 g)，應用線栓法(直徑0.2～0.3 mm，于1.8～2.0 cm處標記)。正中切口，分離頸前區腺體及結締組織，暴露并分離左側頸總動脈、左側頸外動脈及其分支、左側頸內動脈，暫時阻斷頸總動脈及頸內動脈血流，離斷頸外動脈分支及頸外動脈遠心端，顯微剪在頸外動脈近心端剪一小口，將線栓由頸外動脈-頸動脈分叉-頸內動脈方向進入，達1.8～2.0 cm處停止進入，固定線栓尾部，清理手術創口、消毒、縫合，從線栓置入1.8 cm處計時1 h后拔出線栓。假手術組只切開頸部皮膚，暴露血管結扎頸總動脈及頸外動脈，除不插線栓外，其他步驟同上。術后24 h室內溫度維持在25～28℃之間 ，大鼠體溫維持在35～37℃之間。

1.3動物模型評價 參考Longa等〔3〕進行神經功能評分：0分：無明顯神經病學癥狀；1分：不能完全伸展左側前爪；2分：行走時向左側旋轉；3分：行走時向左側傾倒；4分：不能自行行走，意識水平下降。排除標準:①無明顯神經功能缺損表現或癥狀很輕的大鼠;②手術造成蛛網膜下腔出血的大鼠;③手術時出血較多,癥狀很重，意識狀態不好甚至死亡的大鼠。剔除的大鼠隨機填補。

1.4動物分組 將大鼠分為3組：假手術(對照)組30只、缺血組30只、治療組30只，每組中各分出15只單獨喂養，在實驗第1天進行頸動脈超聲檢測，記錄雙側頸動脈最高血流速度。

1.5灌胃方法 治療組1 ml濃縮藥液/次(桂枝茯苓丸溫開水稀釋，0.85 g稀釋為1 ml)〔4〕早晚各灌胃1次，對照組和缺血組灌等量生理鹽水，連續2 w。

1.6血清制備 各組灌胃2 w后，余15只大鼠于第15天分別用 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，開胸暴露心臟，采用心臟穿刺取血，收集血液標本，置于離心管中，輕輕顛倒混勻，放入高速離心機3 000 r/min，離心15 min，收集上層液作為待測血清，放置4℃冰箱保存。

1.7腦組織勻漿 留取血清同時分別留取大鼠腦組織，具體方法為用鑷子由枕骨大孔處向兩側撥開顱骨，取出患側腦組織(左腦)離心管稱重，計算出腦濕重，液氮保存；標本置勻漿器內加生理鹽水(按照W/V為1∶2)，冰水中研磨勻漿約10 min，移至1.5 ml EP管中，4℃條件12 000 r/min，15 min離心取上清，-20℃保存。

1.8檢測指標 采用試劑盒方法(酶聯免疫和放免法)檢測各組血清和腦勻漿TNF-α、ET-1含量。第15日再次檢測雙側頸動脈超聲，記錄最高血流速度，波幅的高低代表頸動脈收縮期最大血流速度，頻率的多少代表大鼠的心率。

1.9數據分析 應用SPSS17.0軟件包進行非參數檢驗及方差分析。

2 結 果

2.1各組頸動脈血流速度的比較 經過15 d治療，治療組頸動脈血流速度較治療前明顯增加(P<0.05)，與對照組和缺血組相比，治療組頸動脈血流速度明顯增加(P<0.05)，對照組和缺血組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1，表1。

2.2治療后各組血清及腦組織中TNF-α及ET-1含量 缺血組血清、腦組織勻漿中TNF-α水平較對照組明顯增高(P<0.05)；較治療組明顯增高(P<0.05)。缺血組腦組織勻漿、血清中ET-1水平較對照組明顯增高(P<0.05)，較治療組明顯增高(P<0.05)。見表2。

治療前

治療后

組別治療前治療后對照組37.20± 2.8537.67±4.081)缺血組44.00±4.9341.93±3.411)治療組52.20±5.6169.53±19.442)

與治療組比較：1)P<0.05；與治療前比較：2)P<0.05

表2 治療后各組血清及腦組織中TNF-α水平比較

與對照組比較：1)P<0.05；與缺血組比較：2)P<0.05

3 討 論

桂枝茯薈丸出自于《金匱要略》〔5〕，是作為消除婦科腫塊的方劑記錄下來的，在婦科疾病的治療中取得了顯著療效〔6〕。隨著研究人員對其化學成分及藥理作用的深入研究及臨床、動物實驗的開展，不斷拓展了其應用，目前在治療內科〔7，8〕、外科〔9，10〕、皮膚〔11〕等各科疾病也起到了重要作用〔12〕。

CI發生后，由于腦組織缺血缺氧，不僅會產生大量抗原刺激免疫系統，而且有大量的炎性細胞浸潤和激活，引起免疫應答過程，導致T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核巨噬細胞、內皮細胞等被激活，從而產生大量TNF-α、白細胞介素等細胞介質和神經調質參與CI病理變化過程〔13〕。腦I/R時，管腔狹窄，激活的中性粒細胞和血管內皮細胞釋放大量ET〔14〕，同時升高的 ET 又作用于病灶區，引起腦血管強烈收縮，而致病變區繼發缺血性損害，加重神經功能損害〔15〕。 目前的動物實驗和臨床研究〔16，17〕表明，CI急性期的血漿TNF-α、ET水平與梗死灶大小、腦水腫程度及臨床癥狀的嚴重程度一致。在正常生理情況下，ET和NO處于動態平衡，以維持體內血管的正常舒縮功能，在急性腦缺血或腦I/R超早期，NO可發揮重要的腦保護作用。但是在腦缺血及腦I/R后期，由于NO的神經毒性作用替代了其保護作用，NO/ET平衡紊亂，NO和ET含量同時升高進一步造成腦組織損傷。另外TNF-α的上調可以通過促進血管內皮細胞黏附分子的黏附、血小板性血栓的形成，進而促進梗死期腦組織缺血壞死〔18〕。腦缺血期及I/R后期，降低血漿TNF-ɑ水平，抑制NO合酶(NOS)活性，進一步減少ET含量或抑制其受體，是減輕缺血性及再灌注性腦損傷的重要途徑〔19〕。

桂枝茯苓丸是活血利水方，組成成分包括芍藥、桂枝、桃仁、茯苓、牡丹，方中桂枝溫經通絡，配合茯苓達到健脾利水消痰作用，丹皮、芍藥、桃仁活血散淤消癥，共奏活血消痰利水之功，這與CI痰淤互結病理特征一致〔20〕。現代藥理研究表明桂枝茯苓方具有抗炎〔21〕、免疫調節〔21〕、保護血管內皮細胞〔22〕、抗氧化〔23〕、改善循環〔20〕等作用。現代動物研究表明桂枝茯苓丸可通過抑制興奮性氨基酸、抑制缺血及再灌注后鈣離子大量內流、拮抗TNF-α 參與的炎癥反應、拮抗NO介導的ET-1所致的神經損傷等作用機制，從而治療CI〔24～26〕。本實驗結果發現桂枝茯苓丸可降低I/R腦損傷大鼠TNF-α和ET-1水平，抑制炎癥反應，減少血管內皮細胞合成釋放 ET-1，改善腦循環，保護腦組織細胞。