硫化氫對長期過量飲酒小鼠心肌纖維化及miR-221表達的影響

肖 婷 宋宗仁 劉鴻濤 郭亞芹 張 樂 王 芳 楊 軍

(深圳市龍華區中心醫院心血管內科，廣東 深圳 518110)

心肌在長期過量飲酒情況下，可出現許多的病理改變，心肌纖維化是其中重要的病理改變之一〔1〕。而心肌纖維化常常是導致許多心血管疾病發生心律失常和發展為心力衰竭的關鍵環節。微小RNA(miRNA)是一類長度20～25個核苷酸大小、機體內源性表達的單鏈非編碼RNA分子，具有負向調節基因表達的功能。miRNAs通過與靶mRNA的3′-非編碼區特定序列互補配對，引起翻譯抑制或結合后降解，進而對基因表達進行轉錄后負向調控。基于此生物學功能，其參與了調控機體許多重要的生物學過程，如細胞增殖、分化、衰老及癌變〔2～4〕。有證據表明，miRNAs可通過調控靶基因的表達，參與調控心肌纖維化過程〔5〕。研究證實，硫化氫(H2S)在心血管系統中具有廣泛的生物學效應，可在多種心肌損傷模型中發揮心肌保護作用〔6〕。有研究還顯示H2S可改善長期攝入酒精導致的左室重構〔7〕。本研究旨在探討H2S對酒精性心肌纖維化的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物、藥品與試劑 44只健康雄性昆明小鼠，體重16～21 g，由南華大學實驗動物中心提供。硫氫化鈉(NaHS)和DL-炔丙基甘氨酸(PAG)由 Sigma公司提供。Trizol試劑由Invitrogen公司提供。逆轉錄試劑盒由Fermentas公司提供。

1.2方法

1.2.1分組、模型建立及干預方案 44只小鼠隨機分為4組：對照組、模型組、NaHS組和PAG組，其中對照組與模型組每組各10只，NaHS組與PAG組每組各12只。實驗前在實驗室適應性喂養1 w，使小鼠適應環境。模型組、NaHS組及PAG組小鼠經連續12 w每日自由飲用4%(V/V)的乙醇水溶液(4%的乙醇水溶液是唯一飲用水源)制作酒精性心肌纖維化模型〔8〕，對照組予以每日自由飲用清潔水。造模開始的同時，NaHS組給予每天腹腔注射NaHS溶液(50 μmol/kg)，PAG組給予每天腹腔注射PAG溶液(40 mg/kg)。對照組與模型組給予每天腹腔注射等體積生理鹽水。

1.2.2標本采集 造模第12 w末時，采用腹腔注射水合氯醛對小鼠進行麻醉，固定小鼠，打開胸腔，快速取出心臟，去除心包膜、血管等其他組織，用冰生理鹽水沖洗干凈，濾紙弄干。取左室部分心肌迅速放入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋切片，用于行VG染色和Ⅰ型膠原免疫組化。取部分左室心肌組織凍存于-80℃冰箱，用于實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測。

1.2.3VG染色觀察心肌膠原沉積 取4%多聚甲醛固定后的心肌組織，行常規梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋后，制備組織切片，切片厚度約4 μm，然后進行VG染色，間質膠原纖維呈紅色，于光鏡下觀察。

1.2.4免疫組化檢測心肌組織Ⅰ型膠原表達 石蠟包埋4%多聚甲醛固定的心肌組織，制備組織切片。切片常規脫蠟和水化，3%過氧化氫(H2O2)處理，抗原修復。以正常山羊血清封閉，滴加稀釋一抗Ⅰ型膠原抗體(1∶100)，37℃孵育90 min。磷酸鹽緩沖溶液(PBS)漂洗，滴加二抗，37℃孵育15 min，PBS漂洗，顯色劑顯色。然后以蘇木素復染，脫水、透明，封片，鏡檢。最后在顯微鏡下進行觀察，胞質內出現棕色定位明確的顆粒物質為陽性細胞表達。

1.2.5RT-qPCR檢測miR-221的表達 取-80℃凍存的心肌組織，按照Trizol試劑說明提取心肌組織總RNA，紫外分光光度計檢測RNA的純度和濃度。逆轉錄試劑盒購自Fermentas公司，按照說明轉錄得到cDNA。選用U6為內參。引物序列(5′-3′)如下：U6：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT；mir-221：ACCTGGCATACAATGTAGATTTC。PCR反應體系如下：Template(反轉錄產物)1 μl，引物A (10 μmol/L)0.5 μl，引物B(10 mol/L)0.5 μl，PCR H2O 13 μl，2×SYBR Green PCR混合物15 μl 。PCR擴增程序：95℃預變性10 min,隨后進入循環，95℃變性5 s,60℃退火延伸30 s,進行40個循環。數據采用2-ΔΔCt法分析。

1.3統計學處理 應用SPSS18.0 軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1心肌組織VG染色結果 模型組心肌組織中紅染的膠原纖維較對照組明顯增多，即心肌纖維化加重。NaHS組心肌組織中紅染的膠原纖維較模型組明顯減少，即心肌纖維化減輕。PAG組與模型組相比，紅染膠原纖維進一步增多，心肌纖維化更為明顯。見圖1。

2.2Ⅰ型膠原蛋白免疫組化結果 模型組心肌組織中棕黃色陽性物質顯著多于對照組，即模型組Ⅰ型膠原蛋白表達顯著高于對照組。NaHS組棕黃色陽性物質較模型組顯著減少，即NaHS組Ⅰ型膠原蛋白表達較模型組顯著降低。相反，PAG組與模型組相比，棕黃色陽性物質進一步明顯增多，即Ⅰ型膠原蛋白表達進一步顯著升高。見圖2。

圖1 各組心肌組織VG染色結果(×100)

圖2 各組心肌組織Ⅰ型膠原的表達(DAB，×400)

2.3各組心肌組織miR-221表達水平比較 模型組心肌組織中miR-221表達水平(1.67±0.12)顯著高于對照組(1.00±0.05，P<0.05)，NaHS組心肌組織中miR-221的表達水平(1.28±0.03)較模型組顯著下降(P<0.05)，PAG組(2.12±0.12)與模型組相比，miR-221表達水平進一步明顯增高(P<0.05)。

3 討 論

研究證實長期大量飲酒可導致出現以心臟擴大、肌纖維結構紊亂、收縮功能下降為特征的心肌重構〔9,10〕。同時，心肌纖維化也是慢性酒精性心肌損傷發生的一個重要環節。過量攝入酒精可使心肌細胞受損，從而繼發心肌成纖維細胞增殖和基質膠原纖維蛋白分泌的增加，形成心肌纖維化〔11〕。本實驗結果同樣證實了長期過量飲酒可導致心肌纖維化發生。

H2S是近年來發現的一種小分子氣體遞質，可以自由滲入細胞膜發揮生物效應。在哺乳動物體內，H2S可通過酶促反應途徑產生，由磷酸吡哆醛-5′-磷酸依賴酶，主要為胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和胱硫醚-β-合成酶(CBS)，催化底物L-半胱氨酸而成。其中CBS主要高表達于腦組織中，而CSE 主要存在心血管組織中。H2S在心血管系統中具有重要的調節功能，參與調控許多心血管疾病的發生發展過程。Mani等〔12〕發現內源性H2S可通過抑制血管內膜的增殖和黏附分子的表達保護血管免受粥樣硬化損傷，而減少內源性H2S生成可加速血管動脈粥樣硬化的發展。Zhou等〔13〕在鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病心肌病模型中發現，H2S可通過抗炎、抗氧化應激及抗細胞凋亡等機制減慢糖尿病心肌病的發展。本研究結果提示H2S可有效減輕酒精性心肌纖維化。

有研究發現miRNAs參與高血壓、心肌缺血、心肌梗死、心力衰竭、心肌病等多種心血管疾病的心肌纖維化過程，具體機制為直接抑制多種細胞外基質蛋白的表達或參與調控多條與心肌纖維化相關的信號通路〔14〕。miR-221是一種廣泛存在于各種組織中的miRNA。蘇明〔15〕通過構建心肌特異miR-221轉基因小鼠，結果發現小鼠在大約1月齡時心臟明顯擴大，心臟重量指數明顯增大，心肌纖維化程度顯著增加。而其具體機制與miR-221調控p27/CDK2/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路介導的自噬有關。長期過量飲酒在引起小鼠心肌纖維化的同時，可以上調miR-221的表達，這提示miR-221可能參與了酒精性心肌纖維化的發展過程。而H2S在減輕酒精性心肌纖維化的同時可下調miR-221的表達，這提示下調miR-221的表達可能是H2S減輕酒精性心肌纖維化的重要內在機制。

綜上所述，我們初步認為H2S具有改善長期過量飲酒導致的心肌纖維化的作用，其內在機制可能與H2S下調miR-221的表達有關，而其詳細的機制有待進一步研究。