miRNA-423-5p與心力衰竭發病的相關性

劉小燕 陳文江 王 江

(第三軍醫大學第二附屬醫院新橋醫院心血管內科，重慶 400037)

心力衰竭(HF)是臨床常見各種心臟疾病的終末期綜合征，隨著我國人口的老齡化進程，HF的發病率呈逐年增加的趨勢，據我國最新心血管病調查報告顯示：我國人群慢性心力衰竭患病率為 0.9%(其中男性 0.7%，女性 1.0%)；其患病率隨著年齡增加而顯著上升；我國北方人群發病率高于南方人群(1.4% vs 0.5%)，且城市人群發病率高于農村人群(1.1% vs 0.8%)〔1〕。HF的主要病因已經從風濕性瓣膜性心臟病轉變成冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，而且高血壓、糖尿病、心房顫動等都是導致HF的病因。近10余年來，HF的病理生理機制得到進一步研究，同時新的治療方法被發現，尤其是干細胞治療、免疫調節治療、基因治療等，為未來HF的治療展現了新希望。近年來，不斷有研究發現在HF的發生發展中有復雜的微小RNA(miRNA)異常表達，提示miRNA可能參與HF的發生發展〔2～5〕。國外研究表明，miRNA-423-5p與HF的發生發展有關，但其研究結果仍存在一定爭議〔6〕，主要可能是與種族、研究樣本等的限制有關。因此，進一步研究miRNA-423-5p與HF的發病的關系顯得尤為重要，以達到早診斷、早預防、早治療HF的目的。本研究擬從中國人群進行miRNA-423-5p與HF的發病關系的研究。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2015年3～9月新橋醫院入院的HF患者40例，另外納入40例年齡、性別等方面匹配的非HF患者。HF患者按照《中國心力衰竭診斷和治療指南2014》〔7〕進行診斷和分級，HF組均為紐約心臟病學會(NYHA)Ⅲ和Ⅳ級。兩組人群在年齡、性別和基本病史方面差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。于患者入院24 h內抽取患者2 ml靜脈血，并分離血漿(3 000 r/min，24℃，10 min)，保存于-80℃冰箱，以備后續實驗用，并收集患者基本病史和生化檢測指標。

1.2miRNA 實時熒光定量檢測 按照說明書用Trizol試劑(Invitrogen，美國)提取所獲取患者血漿的總RNA，然后按照miRNA逆轉錄試劑盒(Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Kit，寶生物工程大連有限公司)說明書對所提取總RNA進行miRNA的逆轉錄，然后按照實時熒光定量PCR試劑盒(寶生物工程大連有限公司)說明書進行實時熒光定量：95℃預變性30 s；95℃擴增、延伸15 s；60℃退火30 s，共40個循環，以U6作為內參，miRNA-423-5p(UGAGGGGCAGAGAGC GAGACUUU)和U6引物由寶生物工程大連有限公司設計合成，而其下游引物為試劑盒配備通用引物。本研究采用2-ΔCt相對定量方法對數據進行分析：ΔCt(實驗組)=Ct(實驗組目標基因)-Ct(實驗組內參基因)；ΔCt(對照組)=Ct(對照組目標基因)-Ct(對照組內參)。

表1 兩組入選人群基本信息(n，n=40)

1.3miRNA-423-5p生物信息學預測 采用生物信息學軟件miRBase〔7，8〕(http：//mirbase.org/)了解miRNA-423-5p的生物學功能，并采用其提供的生物信息學預測軟件MIRDB、MICRORNA、RNA22、TARGETSCAN〔9～13〕對miRNA-423-5p的靶基因和KEGG (京都基因與基因組百科全書)信號通路等，探討其生物功能和可能致病機制。

1.4酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 由武漢博士德生物工程有限公司提供試劑盒(產品號：EK0469)對患者血漿中神經生長因子(NGF)-β進行檢測，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.5統計學方法 采用GraphPad Prism5進行χ2檢驗或Fisher檢驗及t檢驗。

2 結 果

2.1血漿中循環miRNA-423-5p 實時熒光定量結果 HF組miRNA-423-5p的表達水平(0.074 42±0.009 391)明顯高于非HF組(0.021 14±0.005 048，P<0.000 1)，提示miRNA-423-5p可能與HF的發生有關。

2.2miRNA-423-5p的受試者工作特征(ROC)曲線分析 miRNA-423-5p的ROC曲線下面積(AUC)為0.852 8，其95%CI為0.769 1～0.936 5，P<0.000 1，見圖1，提示血漿循環miRNA-423-5p可以作為HF患者的生物標志物。

2.3miRNA-423-5p生物信息學分析 通過MIRDB、MICRORNA、RNA22、TARGETSCAN等在線生物信息

學軟件預測發現，miRNA-423-5p的靶基因主要有：NRSN2(Neurensin-2)、NGF、MAPK1、PIK3CA、IGF1、PRKACA、CPLX2、IMPDH1、KLK4、EVC、C20orf27、TSPAN11、WNT3A、FOXP4、SCN4A、NAT8L、SCAF1、CEND1、MAPKBP1、DDX54、NACC1；其KEGG信號通路主要有Neurotrophin信號通路、Wnt信號通路、醛固酶調控的鈉的重吸收、胰島素信號通路等，見表2，從其預測結果可推測：miRNA-423-5的生物學功能可能主要與調控心臟NGF、Neurensin-2、神經營養因子信號通路、胰島素受體信號通路和Wnt通路等有關，有可能主要是影響HF后的神經重構。NGF屬于對神經元的生長、分化、延長存活期具有促進作用的生長因子家族，該家族主要包括NGF(主要包括NGF-β，2.5S NGF，7.5S NGF)、BDNF、NT-3、NT-4等，因此，我們選擇NGF-β作為候選靶基因進行后續實驗。

圖1 血漿循環miRNA-423-5p 的ROC曲線

ID號名稱靶基因P值Bonferroni校正后P值hsa04910胰島素信號通路KRAS,MAPK1,PIK3CA,PIK3R3,PPP1R3C,PRKAA1,PRKAA2,PRKACB,PRKX,RAF1,SOCS1,SOCS3,SOS2,TSC10.006 2090.033 248 2hsa04710晝夜節律CLOCK,CRY1,FBXW11,NPAS2,PRKAA1,PRKAA2,RORA0.000 454 720.075 028 8hsa05414擴張型心肌病ADCY9,ADRB1,DAG1,IGF1,ITGA2,ITGA6,ITGB8,PRKACB,PRKX,TNF0.0115 7290.049 258 9hsa04310Wnt信號通路BAMBI,CCND1,CCND2,DAAM1,FBXW11,FOSL1,FZD6,NLK,PLCB1,PPARD,PRICKLE2,PRKACB,PRKX,SMAD4,WNT10A,WNT30.001 478 310.243 922hsa04722神經營養因子信號通路CRK,PIK3R20.004 270 660.051 247 9hsa04960醛固酮調控的鈉重吸收IGF1,KRAS,MAPK1,NR3C2,PIK3CA,PIK3R3,SGK10.002 355 660.388 684

2.4兩組血漿NGF-β 表達比較 HF組血漿NGF-β表達〔(301.2±10.31)pg/ml〕明顯高于非HF組〔(91.56±8.477)pg/ml，P<0.000 1〕，說明NGF-β可能參與了HF后心臟的神經重構，也可能為miRNA-423-5p的靶基因。

3 討 論

HF的治療需要不斷的探索和創新，因此，對HF新發病機制的認識將為HF的治療提供新途徑和方法。miRNA是一類小非編碼RNA，本身不具有編碼作用卻可以調控基因的表達。近年研究證實血液、尿液等體液中有miRNA存在，稱之為循環miRNA(cmiRNA)〔14～16〕。cmiRNA通過微小囊泡、與RNA結合蛋白結合和與高密度脂蛋白顆粒結合形成復合物而被分泌出來。cmiRNA不依賴于細胞而存在于體液中，而其在體液中的表達與它們在細胞中表達水平有一定相關性，并且能夠被受體細胞攝取而調節靶基因的表達〔17，18〕。近年來對于這一不依賴于細胞而存在的cmiRNA的研究較多，在心血管疾病主要是在急性心肌梗死方面取得一定成果，最近有研究者提出cmiRNA可能是疾病診斷中一種新的、非侵入性的生物標志物〔19～21〕。cmiRNA在臨床應用的優勢主要由于其便于獲取、易于研究，因此cmiRNA與心血管疾病的研究具有一定前景。本研究提示在HF患者血漿中循環miRNA-423-5p可以作為HF發生新的生物標志物，為HF臨床的診治提供了新的途徑和方法；且miRNA-423-5p有可能主要是通過NGF及其信號通路等影響HF后的神經重構；NGF-β可能參與HF的發生，并可能為miRNA-423-5p的靶基因。由于miRNA調控基因的多樣性和復雜性及本研究所用研究人群較小，因此，關于循環miRNA-423-5p與HF發病機制的研究還有待進一步研究，關于NGF-β與心衰的具體機制和其與miRNA-423-5p是否互為調控或者為其靶基因，還有待后續相關實驗進行驗證。