轉AhDREB1基因花生T₂代植株耐鹽性分析

郭瑞杰 李文 劉風珍 張昆 萬勇善

摘要： DREB1 （dehydration responsive element binding protein） 是植物中特有的一類轉錄因子，在調控與逆境誘導相關基因的表達、參與植物對鹽脅迫的響應及適應過程中具有重要作用。本研究以轉AhDREB1基因T2代花生植株及其受體品種豐花2號（對照）為材料，苗期用1% NaCl 進行鹽脅迫處理，分析脅迫前后植株表型和基因表達變化，并對SOD、POD活性和MDA、可溶性蛋白含量等生理指標進行測定。結果表明：鹽脅迫下，轉基因植株葉片保綠程度及根系生長狀況明顯好于對照。轉基因植株DREB1基因表達量升高、響應鹽脅迫速度比對照快。轉基因植株參與鹽脅迫響應的SOD、POD活性和可溶性蛋白含量高于對照，MDA含量低于對照，說明AhDREB1基因過量表達能有效提高花生的耐鹽性。篩選出耐鹽性較好的轉基因單株4個，分別是D254、D380、D385、D448。

關鍵詞：花生；DREB1；表型；表達量；生理指標；耐鹽性

中圖分類號：S565.201文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）06-0072-07

Abstract As a specific transcription factor in plants， DREB1 （dehydration responsive element binding protein） plays an important role in regulating the expression of stress-induced related genes and involves in the response and adaptation of plants to salt stress. In this study， T2 transgenic peanut plants of AhDREB1 and its receptor Fenghua 2 （control） were used as the materials. The seedlings were conducted salt stress treatment with 1% NaCl， and the changes of phenotype and gene expression before and after stress treatment were analyzed. The physiological indexes such as activities of SOD and POD， contents of soluble protein and MDA were measured. The results showed that under salt stress， the green degree and root growth of transgenic plants were better than those of control. The expression level of DREB1 in transgenic plants increased and the response to salt stress was faster than that of control. The activities of SOD and POD and the content of soluble protein of transgenic plants were higher than those of control， and the content of MDA was lower. These results indicated that overexpression of AhDREB1 could enhance the salt tolerance of transgenic peanut plants. Four transgenic plants with better salt tolerance were screened， namely D254， D380， D385 and D448.

Keywords Peanut； DREB1； Phenotype； Expression quantity； Physiological index； Salt tolerance

鹽堿土在全球范圍內分布廣泛，約有 100×108 hm2土地受到不同程度鹽漬化的威脅[1]。我國鹽漬土地面積約占全球的1/10[2]，占全國耕地面積的6.2%。土地次生鹽堿化面積的不斷增加已成為制約我國農業可持續發展的重要因素之一。花生是重要的油料、經濟和蛋白質作物，目前關于花生耐鹽及鹽脅迫下體內離子平衡調節及適應機制的相關研究較少[3]。利用現代生物技術手段培育高耐鹽堿花生新品種對鹽堿地開發利用、增加農民收入具有重要意義。

DREB是一類植物特有且含有1個高度保守AP2結構域的轉錄因子，屬于 AP2/EREBP（AP2/ethylene-responsive element-binding proteins，乙烯應答元件結合蛋白）家族。Stockinger等[4] 首次從擬南芥中克隆到編碼 DREB 蛋白的CBF1基因。Liu等[5]首次從擬南芥中克隆到編碼DREB蛋白的DREB1A和DREB2A基因。Lucas等[6]發現在逆境脅迫下DREB類轉錄因子特異性的與抗逆相關基因啟動子區的DRE/CRT等順式作用元件結合，激發下游靶基因過量迅速表達，使植物體內滲透調節物質和抗氧化酶活性增加，有效提高了植物對高鹽、低溫、干旱等的耐受性。Li等[7]從耐干燥的苔蘚中分離到新型A-5類DREB基因ScDREB8并在擬南芥中進行過表達研究，表明通過正調控下游脅迫相關基因的表達和提高活性氧清除能力，可使鹽脅迫下擬南芥的萌發率和幼苗期耐鹽能力得到顯著提高。劉強等[8]對擬南芥進行DREB基因轉化，證實轉基因擬南芥的高鹽耐受性、抗旱性均比野生型植株增強。研究表明，超表達DREB1A/CBF3、 DREB1B/CBF1 和 DREB1C/CBF2這三個基因中的任何一個都顯著提高轉基因擬南芥對冰凍、干旱和高鹽的耐受性[5， 9， 10]。在不影響植株正常生長的情況下，轉GmDREB2基因大豆對干旱和高鹽脅迫的抗性增強[11]。同樣在脅迫誘導RD29A啟動子控制下，過表達OsDREB2A基因的轉基因水稻也表現出對干旱、高鹽耐受性的提高[12]。

張梅等[13]發現花生的PNDREB1（GenBank登錄號為FM955398）能被低溫強烈、迅速誘導表達，并對干旱脅迫也有一定程度的響應。李文[14]對花生AhDREB1研究發現，干旱脅迫下不同品種基因表達量的差異直接影響下游抗旱相關基因的表達，決定了品種抗旱性。翟迎慧[15]得到轉AhDREB1基因植株的基因表達量顯著高于對照，干旱脅迫下，轉基因植株的脯氨酸含量和SOD、POD、CAT等酶活顯著高于對照，MDA含量顯著低于對照，說明存在干旱脅迫響應應答。

目前轉錄因子DREBD功能驗證大部分是在模式植物擬南芥和煙草中進行耐鹽脅迫響應應答研究，在花生中則主要是干旱脅迫響應情況，對DREB1基因在花生耐鹽性及耐鹽性狀的分析研究較少。本研究以轉AhDREB1基因花生T2代植株為材料，分析鹽脅迫下的植株表型和基因表達情況，并對SOD、POD活性、MDA和可溶性蛋白含量等生理性狀進行測定，探討AhDREB1基因編碼的轉錄因子與花生植株耐鹽性的關系，以期為研究DREB1基因在鹽脅迫下的生理功能及適應機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

本試驗PCR鑒定所用T2代單株源自轉DREB1基因的花生T1代種子。具體獲取方法：課題組前期構建了含有花生DREB1基因的過表達載體pGBDREB1[16]，通過農桿菌介導法導入栽培種豐花2號[14]，留種得到T1代轉基因種子。

本試驗所用轉DREB1基因的T2代幼苗由前期PCR鑒定得到，用作鹽脅迫處理，分析植株表型、基因表達及進行生理性狀測定。

所有試驗均以豐花2號為對照（CK）材料。

超快新型植物 RNA 提取試劑盒（GK 系列）購自北京華越洋生物科技有限公司；SYBR Premix EX Taq（Perfect Real Time）、 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit均購自寶生物工程有限公司（TaKaRa）；其他試劑均為進口或國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 T2代轉DREB1基因花生植株的PCR鑒定 采用上層育苗盤中河沙固定苗、下層水培盒中營養液提供營養的沙水結合方法種植T1代種子，單粒播，置于25℃、16 h光照條件下。待T2代植株長到兩片真葉展開時，用改良1/5 Hoagland營養液進行培養，出苗7 d后編號，摘取幼葉進行基因組 DNA的PCR檢測，以確定轉基因單株。PCR鑒定標記基因bar所用引物：bar-F：5′-GTCTGCACCATCGTCAAC-3′；bar-R：5′-GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3′。

1.2.2 T2代轉DREB1基因植株的鹽脅迫處理 經PCR鑒定的T2代轉基因植株培養至出苗21 d后，將維持轉基因和對照植株生長的營養液更換為含有1% NaCl的營養液進行鹽脅迫處理。

1.2.3 鹽脅迫下T2代轉基因植株表型鑒定 鹽脅迫0、4 d時照相記錄并觀察轉基因和對照植株的表型變化。

1.2.4 鹽脅迫下T2代轉基因植株表達量鑒定 鹽脅迫0、1 h時取幼嫩葉，液氮冷凍，熒光定量PCR檢測AhDREB1基因表達量變化。具體操作步驟如下：

熒光定量模板cDNA的獲取：參照華越洋RNA快速提取試劑盒（GK系列）操作步驟并加以優化進行花生葉片總RNA提取操作，并按照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒操作說明進行RNA反轉錄獲得cDNA鏈。

熒光定量PCR特異引物為qDREB-F：5′-AATGTGGCTCGGAACTTAC-3′；qDREB-R：5′-GATTGGCTACGGCTTCAT-3′。18S rRNA作為內參基因：18S rRNA-F：5′-GAAACGGCTACCACATCCAAG-3′；18S rRNA-R：5′-CCAACCCAAGGTCCAACTACG-3′。

參照寶生物試劑盒SYBR Premix EX Taq說明配制20 μL的qRT-PCR反應體系，采用兩步法進行定量反應。條件為： 95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 60 s，40個循環；60～95℃ 每0.3℃收集一次熒光信號。在ABI Step One Plus實時熒光定量PCR儀上進行擴增。

1.2.5 鹽脅迫下T2代轉基因植株生理性狀的測定 鹽脅迫0、6 h時取功能葉，液氮速凍，用于超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性和丙二醛（MDA）、可溶性蛋白含量等生理性狀的測定。其中， SOD活性采用氮藍四唑光還原法（NBT）進行測定[17]； POD活性采用愈創木酚法進行測定[18]； MDA含量采用硫代巴比妥酸法（TBA）進行測定[17]；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250法進行測定[19]。

1.3 數據處理

利用Microsoft Excel 2003處理數據并作圖。

基因相對表達量=2-△△Ct [注： -ΔΔCt=-（ΔCt，a-ΔCt，b），Ct：熒光閾值；a：目的基因AhDREB1；b：內參基因18S rRNA ]；

相對值=鹽脅迫后生理性狀測定值/鹽脅迫前生理性狀測定值；

增幅=鹽脅迫后生理性狀測定值-鹽脅迫前生理性狀測定值。

2 結果與分析

2.1 T2代轉DREB1基因花生植株的PCR檢測

試驗以157個T2代單株的葉片基因組DNA為模板進行PCR擴增。擴增產物于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性單株DNA擴增出分子量是424 bp的特異性目的條帶（圖1所示部分陽性單株），試驗共獲得24個轉DREB1基因花生單株。

24株轉基因單株被用于下一步鑒定鹽脅迫相關的生理性狀變化，其遺傳關系如表1所示。

2.2 鹽脅迫下T2代轉基因植株表型變化

鹽脅迫0 d時，T2代轉基因植株與豐花2號（CK）植株長勢旺盛且基本一致，植株的功能葉和老葉顏色呈深綠色，幼嫩葉及未展開葉顏色呈嫩綠色（圖 2A）。鹽脅迫4 d 后，植株生長狀況如圖 2B 所示。轉基因植株和CK植株均出現了不同程度的葉片萎蔫失綠變黃現象。轉基因植株萎蔫程度低，葉片保綠程度明顯高于對照；整株出現真葉閉合的感夜運動；植株的未展開葉受鹽脅迫傷害較小，衰老葉黃斑點逐漸由邊緣向中心蔓延，多數功能葉顏色呈綠色；雖然植株根系顏色變黃并且側根數目減少，主根根尖部位顏色些許變褐，但整體生長狀態較好。CK植株受鹽脅迫傷害程度大于轉基因植株，表現在CK的主莖及側枝的功能葉片已經枯萎下垂，葉片存活數少于轉基因植株，部分葉片基部顏色呈發黃趨勢；主莖變褐色，根系顏色變成黑褐色，側根長及側根數目明顯低于轉基因植株。

2.3 鹽脅迫下T2代轉基因植株中AhDREB1基因表達量分析

鹽脅迫0 h時，轉基因植株（D146除外）中AhDREB1基因的表達量均高于CK；AhDREB1基因在不同轉基因單株的本底表達水平不盡相同，D380中表達量最高，是CK的 50.2 倍。鹽脅迫1 h后，轉基因植株和CK中AhDREB1 基因的表達量均上調，說明AhDREB1基因受鹽脅迫誘導；CK中AhDREB1基因的表達量增幅0.53，是脅迫0 h時的1.53倍；87.5%的轉基因植株中AhDREB1基因的表達量增幅在1.78～14.54，其中D254單株響應鹽脅迫速度最快，增幅達14.54，而D188以較緩慢的速度響應鹽脅迫（圖3）。

2.4 鹽脅迫下T2代植株耐鹽相關生理性狀分析

2.4.1 SOD 活性變化 鹽脅迫0 h時，轉基因和CK植株中SOD活性存在差異。大部分轉基因植株的SOD活性高于CK。鹽脅迫6 h后，轉基因和CK植株中 SOD活性幾乎都升高，其中D448中SOD 活性明顯高于CK，酶活升高率是CK的3.2倍，并且比脅迫0 h時升高了 254個酶活性單位，而D151中 SOD活性是CK的1.94倍（圖4）。

2.4.2 POD活性變化 鹽脅迫0 h時，轉基因植株的POD活性顯著高于CK，其中D254的POD活性是CK的3.7倍。鹽脅迫 6 h后，除D453、D184和D242外，其它植株中 POD活性都明顯升高；不同轉基因植株的POD活性升高了1.03～2.08倍，以D151葉片的POD 活性增幅最高，達12.7個酶活單位，是脅迫0 h的2.08倍；CK僅升高了1.4個酶活單位（圖5）。

2.4.3 MDA 含量變化 鹽脅迫0 h時，轉基因植株的MDA含量與CK相比均處于低水平狀態。鹽脅迫6 h后，所有植株葉片細胞膜的膜脂過氧化水平都上升，膜系統受到傷害，但丙二醛含量增加幅度在植株間存在差異；CK葉片的MDA含量增幅是2.4，相對值是1.33；轉基因植株的MDA含量增幅范圍為0.05～2.06，多數轉基因植株的MDA 含量增幅都遠低于CK（圖6）。

2.4.4 可溶性蛋白含量變化 鹽脅迫0 h時，75%的轉基因花生植株葉片中可溶性蛋白含量高于CK，其中D448的可溶性蛋白含量為10.4 mg/g，是CK的3.5倍；但D329的可溶性蛋白含量僅是CK的0.64倍。鹽脅迫6 h后，轉基因花生植株的可溶性蛋白含量均明顯增加，但增加速度存在差異； D153中可溶性蛋白含量升高速度最快，是脅迫0 h的2.5倍，脅迫后的CK僅升高了0.25 mg/g，相對值是1.08（圖7）。

3 討論與結論

本試驗在課題組前期獲得轉AhDREB1基因T1代花生植株的基礎上，以T2代轉基因單株為材料進行研究。發現鹽脅迫0 h時，T2代轉基因植株中AhDREB1基因表達量高于豐花2號（CK），鹽脅迫1 h后，轉基因植株響應鹽脅迫速度比CK快。鹽脅迫 4 d 后，高鹽抑制了CK的根部和地上部生長，轉基因植株葉片保綠程度及根系生長狀況明顯優于CK。證實DREB1基因在花生耐鹽通路中發揮了一定的作用。Bouaziz等[20]證明與野生型相比，轉StDREB1基因過表達的馬鈴薯植株具有較強的耐鹽抗旱性。這也與本試驗結果證實DREB1轉錄因子基因參與鹽脅迫響應應答一致。

酶促系統能降低植株體內活性氧含量，從而延緩植株衰老，提高抗性。SOD 是活性氧清除系統中首要發揮作用的抗氧化酶，作用于活性氧大量生成的部位催化超氧離子的歧化反應，SOD與POD等協同抵御過氧化物自由基對膜系統的損害[21]，在逆境中保護植物細胞膜。研究證明各抗氧化酶酶活與植物耐鹽性呈正相關[22， 23]。本研究得出轉AhDREB1基因花生植株的 SOD、POD活性和可溶性蛋白含量在鹽脅迫6 h 后均高于CK，MDA含量低于CK，表明轉基因植株的質膜損傷程度低于CK。轉基因單株D380、D385中AhDREB1基因表達量在脅迫前后都高水平表達，鹽脅迫0 h時，其SOD、POD 活性和可溶性蛋白含量均高于CK，在經鹽處理6 h后，其MDA含量低于CK，SOD、POD和可溶性蛋白性狀檢測值均高于CK。由于轉基因單株遺傳背景的差異致使單株間基因表達量和鹽脅迫相關生理性狀檢測值出現顯而易見的差異，即使同屬一株系如16D287-2株系中的9個陽性單株間也存在差異，推測是由外源片段插入位點不同所造成，有待于進一步試驗確認。綜上結果分析，推測AhDREB1基因超表達能夠提高轉基因花生植株對鹽脅迫的耐受性。

本試驗從轉基因T2代單株的鹽脅迫后表型、AhDREB1基因表達量和抗氧化酶系統等相關分子及生理性狀變化中篩選出耐鹽性較好的4個轉基因單株，分別是D254、D380、D385和D448，為深入研究DREB1轉錄因子調控下游靶基因表達及其耐鹽網絡的構建提供了材料。

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