高通量分子標記技術輔助回交選育高油酸花生新種質

徐平麗 唐桂英 付春 柳展基 魯成凱 姜言生 單雷

摘要：以山東大花生魯花14號（LH14）為母本、高油酸花生開農176（KN176）為父本配置雜交組合，再以LH14為輪回親本歷經4次回交獲得BC4F1，期間用TaqMan探針標記技術輔助雜種AhFAD2B基因型選擇；BC4F1經連續自交、田間篩選并輔助KASP分子標記鑒別后代籽粒AhFAD2B基因的基因型，獲得基因型aabb的BC4F5株系10個，它們分別來源于BC4F1代7個單株。分析這10個株系產量及品質性狀，結果顯示各株系結果集中，單株平均莢果數、果型與母本LH14相似，油酸含量為68.67%～77.93%；其中7個株系的百果重、飽果率和6個株系的百仁重分別比對照LH14提高0.02%～16.05%、4.55%～12.31%和0.05%～9.41%。綜合各株系田間表現及籽粒品質指標，最終選擇油酸含量高于70%的7個BC4F5代株系進行DUS測試、品種區試和生產試驗。TaqMan探針標記與KASP標記結合應用于高油酸品種選育過程中，大大減少了田間選擇的工作量，提高了回交選育高油酸花生的效率。

關鍵詞：花生；高油酸；回交；分子標記輔助選育

中圖分類號：S565.203.5文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）06-0046-07

Abstract The cross combination， Luhua 14 （LH14） ×Kainong 176 （KN176）， was made using large-seeded peanut cultivar LH14 as female parent and KN176 with high oleic acid content as male parent. Furthermore， using LH14 as recurrent parent，BC4F1 generation was obtained by successive backcrosses for 4 times. The AhFAD2B genotype single plant from each generation （including F1 and BC1F1-BC4F1） was determined by TaqMan probe method. Ten lines of BC4F5 generation derived from 7 single plants of BC4F1 were obtained by continuous self-crossing through screening in field by agronomic traits combined with genotype identification of AhFAD2B gene by high-throughput KASP molecular marker. These 10 BC4F5 lines with aabb genotype were evaluated in yield and quality traits. The results showed that the average pod number and pod shape of each line were similar to those of maternal LH14， and the oleic acid content of different lines arranged from 68.67% to 77.93%. Compared with LH14， the weight of hundred pods and percent of plump pods per plant in 7 lines， and the hundred-kernel weight in 6 lines increased by 0.02%～16.05%，4.55%～12.31 % and 0.05%～9.41%， respectively. According to overall performance of agronomic characters and kernel quality， 7 BC4F5 lines with oleic acid content above 70% were chosen for DUS test， variety regional trail and production test. The effective application of TaqMan probe method and high-throughput KASP technology in high-oleic peanut breeding greatly reduced the workload of selection in field and improved the breeding efficiency.

Keywords Peanut （Arachis hypogaea L.）； High oleic acid； Backcross； Molecular marker assisted selection

花生是我國重要的經濟作物和油料作物。花生籽粒脂肪酸的組成是衡量花生品質的重要指標。油酸、亞油酸是花生籽粒脂肪酸的主要成分，含量分別占其總脂肪酸含量的36.1%～67.0%、13.0%～43.0%；此外還包括硬脂酸1.3%～6.5%、軟脂酸6.0%～11.5%和亞麻酸（<0.1%）等[1]。油酸含有單不飽和鍵，相比亞油酸、亞麻酸等多不飽和脂肪酸更穩定，提高油酸含量可以改善花生及花生制品的口味和氧化穩定性，因此，高油酸花生作為一種優質的油脂來源，越來越受到消費者的青睞[2，3]。

我國高油酸花生育種研究起步較晚、育成的品種比較少，且大多來源于美國突變體F435及其衍生系。F435的油酸含量80%，亞油酸僅占2%，其油酸性狀由兩對非等位基因AhFAD2A和AhFAD2B控制，AhFAD2A基因448nt處G→A堿基的替代以及AhFAD2B基因442nt處A堿基的插入，導致了高油酸性狀的產生[4-8]。針對這兩個位點，近年來研究者開發了多種類型的分子標記，如限制性酶切擴增多態性（CAPS，cleaved amplified polymorphic sequence）、等位基因特異PCR（AS-PCR，allele-specific PCR）、TaqMan探針標記及KASP（kompetitive allele specific PCR）標記等。這些標記已被用于鑒別AhFAD2A和AhFAD2B基因的等位差異，并開始應用于高油酸花生育種過程[9-12]。

為了選育適應山東及北方大花生產區的高油酸花生新品種，我們以山東大花生品種魯花14號為母本及輪回親本、高油酸花生KN176為父本，將TaqMan探針標記及KASP標記檢測手段輔助應用在整個回交、自交選育過程中，有效縮短了花生高油酸的選育進程，并選育出一系列油酸含量高于70%的花生新品系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 親本材料 母本魯花14號（LH14），O/L比值1.70，山東省花生研究所提供。父本開農176（KN176），O/L比值11.13，開封市農業科學院育成的高油酸花生品種，種子由河南省農業科學院經濟作物研究所黃冰艷研究員提供。

1.1.2 試劑 植物基因組DNA提取試劑盒為北京天根生化科技有限公司（TIANGEN，中國北京）產品；熒光定量PCR使用大連TaKaRa生物技術公司（TaKaRa，中國大連）產品Premix Ex Taq（probe qPCR）；KASP Master mix為LGC公司（英國）產品。

1.1.3 引物和探針 用于熒光定量的引物和探針由上海生工生物工程技術服務有限公司（中國上海）合成，KASP檢測引物由英國LGC公司（英國）合成。花生雜交、回交選育過程中TaqMan qPCR檢測引物和探針序列、KASP檢測的引物序列參見徐平麗等（2016）報道[11]。

1.2 方法

1.2.1 選育過程 2013年春，播種親本LH14和KN176種子于雜交池中，盛花期開始雜交，秋季收獲F1代雜交種子，TaqMan探針法檢測F1代種子AhFAD2A和AhFAD2B基因的基因型，篩選獲得真雜種。KN176 AhFAD2A和AhFAD2B基因型分別為aa和bb， LH14 AhFAD2A和AhFAD2B基因型為aa和BB[13]，兩個親本的AhFAD2A均已突變為aa，因此，F1真雜種 AhFAD2A和AhFAD2B基因的基因型為aaBb，后代檢測只針對AhFAD2B基因型即可。同年冬季于海南加代回交，LH14作輪回親本，F1代基因型aaBb雜交種作父本，回交獲得BC1F1種子，TaqMan探針法篩選基因型aaBb的BC1F1真雜種，用作進一步的回交父本。2014年春、冬兩季和2015年春季，繼續與輪回親本回交、TaqMan探針法篩選基因型aaBb真雜種。2015年秋收獲BC4F1種子，同年冬季于海南自交加代，2016年春收獲BC4F2代種子，播種于濟南飲馬泉試驗基地進行單株選擇，KASP法輔助檢測它們的基因型；秋季單株收獲基因型為 aabb和aaBb的BC4F3代種子。2016年冬及2017年春和冬，株行種植基因型 aabb的選留單株，BC4F4、BC4F5代選擇與LH14田間農藝性狀基本相似株系，并用近紅外反射光譜法對油酸含量進行輔助選擇（圖1）。

1.2.2 花生種子和葉片DNA提取 手術刀切取花生種子遠離胚根端約0.4 mm厚的子葉組織薄片，或取田間新鮮幼嫩花生葉片約1 g，放入1.5 mL Eppendorf管中，按照TIANGEN公司植物基因組DNA提取試劑盒提供的方法提取花生種子或葉片基因組DNA，溶解于適量無菌去離子水中。分光光度計和凝膠電泳檢測DNA的濃度和質量，并稀釋至合適的濃度備用。

1.2.3 TaqMan探針標記檢測AhFAD2B基因型 以基因組DNA為模板，針對AhFAD2B 442位A/- InDel的擴增引物對為qFAD2B-F和qFAD2B-R，區分野生型位點和突變體位點A堿基插入的熒光探針為qFAD2B-p0和qFAD2B-pA442，在ABI7500實時熒光PCR儀（美國應用生物系統公司）上按照基因分型實驗流程操作進行。引物序列信息及PCR反應體系、實驗程序按照徐平麗等（2016）的方法進行[11]。

1.2.4 KASP高通量檢測AhFAD2B基因型 以基因組DNA為模板，針對AhFAD2B 442位A/- InDel的正向引物kFAD2B-F/-D和kFAD2B-F/AI，反向引物kFAD2B-R；引物kFAD2B-F/-D和kFAD2B-F/AI的5′端分別與加尾序列Allele-1 tail和Allele-2 tail相連，等位差異設計在引物kFAD2B-F/-D和kFAD2B-F/AI的3′端。通用引物（與加尾序列相同）的5′端分別標記FAM和HEX熒光。根據收集熒光的不同，確定基因分型。引物信息及KASP反應體系、實驗程序等按照徐平麗等（2016）的方法進行[11]。

1.2.5 回交后代材料的田間選擇 從BC4F2代開始，對自交群體單株進行苗期田間調查，記錄其出苗、苗期生長、開花、結果及抗病性等情況，選擇綜合性狀良好，特別是株型直立、結果集中、飽果率高、果型好的單株繼續傳代進行篩選，并輔助基因型篩選；BC4F4代執行株行選擇，對基因型為aabb的株行田間表現進行調查，選擇整齊一致且收獲期表現良好的株行作為進一步擴繁的材料；BC4F5則選取重要農藝性狀相似于母本材料LH14的優良株行，每個同一來源的株行作為一個株系；基因型為aaBb的優良單株作為備選單株，留作后續基因型隱性純合后進一步田間篩選。

1.2.6 BC4F5代材料高油酸株系產量及品質分析 收獲時統計基因型aabb的BC4F5材料的單株莢果數、飽果率、株型、株高、分枝數等性狀，計算各株系的百果重、百仁重等重要產量指標。BC4F5各株系的各項農藝性狀和產量性狀以輪回親本LH14為對照進行比較。

利用波通儀器公司的DA7250型近紅外分析儀，通過近紅外反射光譜（near infrared reflectance spectroscopy，NIRs），初步分析籽粒的油酸、亞油酸含量、蛋白質含量和含油量等品質指標，設3個生物學重復，統計結果取平均值。

2 結果與分析

2.1 TaqMan探針鑒定F1代及回交各世代花生種子基因型

由于配制組合選用的高油酸親本KN176基因型為aabb，母本材料LH14的基因型為aaBB[13]，因此，基因型aaBb的F1代即為真雜種。為進一步改良母本的油酸性狀，后續回交世代選取基因型aaBb的F1、BC1F1、BC2F1、BC3F1代真雜種依次作回交父本，最終通過一次雜交、四次回交獲得BC4F1代。

F1、BC1F1、BC2F1、BC3F1、BC4F1世代材料樣本量不大，利用TaqMan探針法篩選基因型為aaBb的這些世代真雜種單株材料。受雜交池和海南加代條件等限制，以及雜交技術的影響，盡管我們雜交了大量的花，但獲得的真雜種數量較少，特別是F1代（表1）。不過，由于TaqMan探針法能保證檢測的準確率（>95%），因此這些雜種作為回交父本可滿足回交要求。

2.2 KASP技術鑒定BC4F2及其它自交后代單株的基因型

將基因型為aaBb的BC4F1種子播種在試驗田，結合單株結果數、飽果數、果型、株型、葉型等田間綜合性狀，終選10個單株收獲BC4F2自交后代種子。通過基因型鑒定，aabb和aaBb的BC4F2單株繼續種植，并結合田間綜合表現進行篩選，共獲得25個BC4F3單株（5個aabb，20個aaBb），它們來源于8個BC4F1系。基因型鑒別為aabb的5個單株收獲的BC4F4種子株行種植，進一步選擇綜合性狀表現優良的BC4F5；同時基因型為aaBb單株收獲的種子繼續基因型鑒別和單株選擇，最終篩選獲得來源于7個BC4F1株、基因型為aabb且綜合性狀良好的BC4F5代株系10個，并分別編號（世代-粒編號-株系）。利用KASP標記檢測種子基因型（上代基因型aabb的后代種子不再分型檢測），檢出率高于93.49%，有效保證了選育高油酸性狀的準確性和效率，部分分型結果見表2。

2.3 花生高油酸株系的獲得及BC4F5代材料的產量性狀分析

經過BC1F1、BC2F1、BC3F1、BC4F1各回交后代基因型檢測及BC4F2、BC4F3代自交群體田間單株選擇、BC4F4株行選擇并輔助基因型選擇，篩選獲得來源于BC4F2的7個單株基因型為aabb的BC4F5 10個株系。調查BC4F5代10個株系的各株行田間表現發現，選育的各株系株型直立緊湊、結果集中，4個株系的主莖高為38～45 cm、1個株系高于65 cm、其余株系主莖高在45～65 cm之間，分枝數8～12個，果型與母本LH14相似（圖2，表3）。與對照LH14相比，大多數株系平均百果重、百仁重和飽果率好于對照。其中7個株系平均百果重為172.41～200.04 g，與對照相比，提高幅度為0.02%～16.05%，平均提高（4.98±5.65）%；7個株系的平均飽果率為76.71%～82.41%，提高幅度4.55%～12.31 %，平均提高（8.16±2.80）%；6個株系平均百仁重為73.25～80.10 g，提高幅度為0.05%～9.41%，平均提高（4.81±3.34）%。選出株系單株平均莢果數為16.44～19.65個，與LH14相比沒有明顯差異（表4）。各株系之間以及與對照親本之間，單株平均莢果數差異不顯著，平均百果重、平均百仁重、平均飽果率差異顯著，不同株系之間的表現略有不同，這些將作為終選株系的重要參考指標。

2.4 BC4F5高油酸株系籽粒品質性狀分析

采用近紅外反射光譜法初步分析了BC4F5部分株系（30～50粒/株系）籽粒油酸、亞油酸、蛋白質含量及含油量等品質指標，發現基因型為aabb的BC4F5代10個株系，油酸含量在68.67%～77.93%之間，平均為（74.09±3.37）%，大部分選留株系的油酸含量已達70%以上（表5）。最終，綜合考慮株型、株高、飽果率、百果重及近紅外光譜初步測定的品質指標，選擇7個BC4F5代優良株系作為后續品種比較的材料。其中BC4F5-143-1、BC4F5-145-4、BC4F5-199-8、BC4F5-202-10油酸含量高于75%，BC4F5-144-1、BC4F5-170-6、BC4F5-198-8油酸含量高于73%。株系BC4F5-172-7、BC4F5-176-7油酸含量在68%～69%之間，低于預期，并且它們的株高較高，百果重、飽果率都較低，因此被淘汰。雖然BC4F5-162-5油酸含量也達到73%，但因其株高等因素落選。此外，由于蛋白質、含油量對花生種子的風味和營養價值的影響，后續的研究中也是我們進一步關注的性狀 。

3 討論

截止2016年底，我國共育成38個高油酸花生品種，18個大粒品種，20個小粒品種[2]，高油酸品種相對較少。這些品種主要是通過雙親雜交后系譜法選育的，控制高油酸性狀的基因來源于美國高油酸品種F435及其衍生系。回交選育作為創制優質花生種質資源手段之一，可以通過多輪次回交將某個優良性狀定向轉移到現有推廣的優良品種中，同時保留該品種的其它優良特性。

魯花14號屬于比較適應北方花生產區的大花生，株型直立緊湊，蛋白質含量23.6%，粗脂肪含量52.12%，普通油酸含量48.5%，油亞比1.70，抗旱、較抗多種葉部病害和條紋病毒病，品種適應性廣。父本開農176是我國第一個通過國家鑒定的高油酸花生，油酸含量76.8%，油亞比11.13，與美國F435來源的高油酸突變體基因型相同，控制油酸性狀的兩個基因AhFAD2A/AhFAD2B均已突變。我們期望通過多次回交將開農176的高油酸性狀導入魯花14號，獲得既具備開農176的高油酸性狀又保留了輪回親本魯花14號優良性狀的高油酸新材料。作物回交育種實踐表明，作物性狀遺傳改良通過4～6次回交，多數可以達到預期效果[14]。理論上，通過1次雜交、4次回交，回交后代已具備輪回親本高于96%的性狀，后代已逐步接近輪回親本。選育過程中輔助分子標記技術對與油酸相關的基因型進行篩選，大大減少了后期田間篩選的工作量，顯著提高了育種效率。再者，冬季在海南種子的加代工作，也有效縮短了高油酸花生的選種進程[11]。