花生FAT基因家族的全基因組分析

張會 單雷 李新國 郭峰 孟靜靜 萬書波 彭振英

摘要：酰基-ACP硫酯酶（fatty acyl-ACP thioesterase，FAT）是控制植物種子油脂合成的關鍵酶，根據其氨基酸序列和底物特異性不同可分為FATA和FATB兩類。為了更深入了解花生FAT（AhFAT）的特點與功能，本研究對AhFAT家族基因進行了全基因組生物信息學分析。在花生基因組中共有20個FAT基因，不均勻分布在2個基因組的12條染色體上。20個AhFATs可以分為AhFATA和AhFATB兩個亞家族，AhFATA亞家族有2個基因，AhFATB亞家族有18個基因。AhFATA家族基因具有6或8個外顯子，AhFATB家族基因結構較為復雜，外顯子數目5～8個；AhFATs都不具有跨膜結構域但是都具有保守的Acyl-ACP_TE結構域。對AhFAT家族基因進行可變剪接分析，發現只有少數發生了可變剪接，且具有組織特異性。對AhFATs表達模式分析的結果顯示，AhFATAs和AhFATBs都在種子發育后期表達量較高。

關鍵詞：花生；酰基載體蛋白硫酯酶（FAT）；可變剪接；表達模式

中圖分類號：S565.2：Q7文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）06-0019-08

Abstract Fatty acyl-ACP thioesterase （FAT） is the key enzyme regulating the synthesis of plant seed oil. According to the amino acid sequence and substrate specificity， FAT is divided into FATA and FATB subfamily. In order to better understand the characteristics of AhFAT gene family， the bioinformatics analysis was carried out. There were 20 AhFAT genes in the peanut genome， which heterogeneously distributed on 12 chromosomes in the two genomes. The twenty AhFAT genes could be divided into AhFATA and AhFATB subfamily， which had 2 and 18 members respectively. The AhFATA subfamily owned 6 or 8 exons， and the AhFATB subfamily had complex gene structures with 5～8 exons. None of the AhFATs had transmembrane domains， but they all owned the conserved Acyl-ACP_TE domain. The alternative splicing analysis of AhFAT gene family revealed that only a few AhFATs undergone alternative splicing and they had different splicing types in different tissues. The AhFATs expression pattern analysis results showed that both AhFATAs and AhFATBs expressed at higher levels in the later stage of seed development.

Keywords Peanut； Fatty acyl-ACP thioesterase （FAT）； Alternative splicing； Expression pattern

在高等植物中，脂肪酸生物合成是由位于質體中的Ⅱ型脂肪酸合成酶催化完成的[1]。該反應包括丙二酸單酰輔酶A與酰基-ACP衍生物的聚合反應，使酰基碳鏈以每個循環增加兩個碳單位進行延伸[2]。酰基-ACP硫酯酶（fatty acyl-ACP thioesterase， FAT）終止脂肪酸合成，水解酰基和ACP之間的硫酯鍵，釋放出游離脂肪酸和ACP[3-6]。脂肪酸被運送到細胞質中進一步酯化形成脂酰-CoA，然后在內質網上進行脂肪酸鏈的延長和脫飽和、磷脂和甘油三酯的合成等代謝[7，8]。FAT的特異性在很大程度上決定了大多數植物脂肪酸鏈的長度和不飽和度[9]。

FAT是由核基因編碼的質體靶向的可溶性酶[7]。根據其氨基酸序列和底物偏好性分為FATA和FATB兩個亞家族[10，11]。FATA偏好不飽和酰基-ACP，尤其對18∶1-ACP活性最高[12，13]。相反，FATB通常對飽和酰基-ACP顯示出高活性，但是它對18∶1-ACP也有一定的活性[4，14]。目前，FAT基因已在擬南芥[15]、向日葵[12]、麻風樹[16]、紫蘇[17]、椰子[18]、蓖麻[19]、毛白楊[14]等植物中相繼被克隆。

FAT的底物特異性對確定植物油的脂肪酸組成和含量具有重要意義[4，20-22]。如將擬南芥AtFATA在大腸桿菌中過表達，脂肪酸組成沒有發生變化，但是重組菌株脂肪酸產量相比對照菌株提高了70%，同時胞外游離脂肪酸產量是野生菌株的7倍并占總脂肪酸含量的15%[23]。向日葵FATA1基因在大腸桿菌中表達導致細菌總脂肪酸含量增加，這種增加在游離脂肪酸中最顯著，而對照菌株中游離脂肪酸基本不存在[12]。Bonaventure等發現AtFATB基因發生斷裂后導致不同組織中飽和脂肪酸的總量相比于野生型擬南芥減少了40%至50%，其中棕櫚酸含量明顯降低[15]。這種減少只發生在飽和脂肪酸的胞質池中，影響胞外磷脂的脂肪酸組成、莖和葉中蠟質以及種子中三酰甘油的合成[24]。AtFATB基因的突變降低了突變體的生長速率，導致幼苗在第4周時高度大約是野生型的一半。相反，在擬南芥過量表達AtFATB1則導致棕櫚酸積累，表明AtFATB1對擬南芥棕櫚酸的產量有一定影響[25]。隨后又在麻風樹中克隆得到了FATB1基因，將JcFATB1基因在擬南芥中過表達可導致飽和脂肪酸含量增加，特別是棕櫚酸含量增加，而不飽和脂肪酸水平降低[16]。

花生（Arachis hypogaea L.）起源于南美洲，是我國重要的油料作物之一，在全球許多地區都有種植[26，27]。花生油主要由棕櫚酸（10%）、油酸（36%～67%）和亞油酸（15%～43%）組成[3]。由于FAT對于控制植物油中脂肪酸含量和組成具有重要作用，所以利用FAT降低花生種子中棕櫚酸的相對含量，改良油品質具有重要意義。目前，關于AhFAT的研究多集中在異源表達和底物特異性研究方面。陳高從花生發育種子中克隆了AhFATA基因，該基因在花生所有組織中均有表達，而且在大腸桿菌中表達該基因可以改變其脂肪酸組成，導致棕櫚油酸和油酸積累[24]。后來陳高又從花生種子中克隆了AhFATB1基因，該基因在花生所有組織中均有表達，但是在未成熟種子表達量最高；當其在大腸桿菌中誘導表達時，轉基因菌株中肉豆蔻酸、棕櫚油酸和油酸含量顯著上升[24]。廖伯壽課題組分別從野生花生A. duranensis和A. ipaensis克隆了AhFATB1A和 AhFATB1B基因，分別屬于A-基因組和B-基因組[3]。但是到目前為止，有關AhFAT基因家族的全基因組研究報道較少。本研究針對AhFAT家族基因進行了系統分析，為研究AhFATs的特性及其對花生種子脂肪酸合成的影響提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 AhFAT基因獲取

利用NCBI公布的花生AhFATA基因序列（GU324446.1）和AhFATB基因序列（EF117305.1）作為參考序列在花生基因組數據庫Peanutbase（https：//www.peanutbase.org/）進行比對，得到AhFAT基因并對其進行生物信息學分析。

1.2 AhFAT基因生物信息學分析

利用DNAMAN軟件將獲取的AhFAT氨基酸序列與NCBI中苜蓿（Medicago truncatula，Mt）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，At）、大豆（Glycine max，Gm）的FATA（ACB29661.1、NP_189147.1、XP_006602508.1）和FATB（ADA79524.1、NP_172327.1 、XP_003522440.1）氨基酸序列進行比對，分析序列之間的相似區域和保守性位點。為進一步探究AhFAT的進化關系，我們利用AhFATA（GU324446.1）和AhFATB（EF117305.1）氨基酸序列在植物基因組數據庫Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中進行Blast搜索。從藻類：杜氏鹽藻（Dunaliella salina，Dsa）、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii，Cre）；苔蘚類：小立碗蘚（Physcomitrella patens，Ppa）、地錢（Marchantia polymorpha，Mpo）；蕨類：卷柏（Selaginella moellendorffii，Smo）；單子葉植物：玉米（Zea mays，Zma）、水稻（Oryza sativa，Osa）、高粱（Sorghum bicolor，Sbi）；雙子葉植物：擬南芥（Arabidopsis thaliana，Ath）、大豆（Glycine max，Gma）、油菜（Brassica rapa，Bra）、棉花（Gossypium raimondi，Gra）、蓖麻（Ricinus communis，Rco）、黃瓜（Cucumis sativus，Csa）、毛果楊（Populus trichocarpa，Ptr）、苜蓿（Medicago truncatula，Mtr）、可可（Theobroma cacao，Tca）等17個物種中檢索出同源序列。將檢索得到的序列與AhFAT序列利用軟件MEGA 5.0進行比對，采用臨接法（Neighbor-Joining）構建系統進化樹，Bootstrap重復次數設置為1 000。利用TMHMM（www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和ProtComp 9.0（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？topic=protcomppl&group;=programs&subgroup;=proloc）分析跨膜結構域和亞細胞定位。利用在線SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）進行保守結構域分析。利用GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析基因結構。

1.3 AhFAT基因的可變剪接和表達模式分析

本實驗室前期對栽培花生‘豐花一號的根、葉、果針入土30 d（Seed1）和50 d（Seed2）進行了轉錄組測序，已將數據上傳至NCBI（NCBI： PRJNA354652）。本試驗根據該轉錄組數據中AhFAT的FPKM值，用HemI軟件進行表達模式分析。用ASTALAVISTA program （http：//genome.crg.es/astalavista/）分析其可變剪接情況。

2 結果與分析

2.1 AhFAT家族基因獲取

以NCBI中AhFATA（GU324446.1）和AhFATB（EF117305.1）作為參考序列在花生基因組數據庫Peanutbase進行搜索，找出了20個AhFAT基因（表1）。分析結果發現20個AhFAT基因不均勻地分布于2個基因組中的12條染色體上，其中有9個位于A基因組，11個位于B基因組。Araip.B03上分布有4個AhFATs，Aradu.A01和Araip.B02各有3個，Aradu.A02上有2個，其余8個染色體上各有1個。AhFAT分為AhFATA和AhFATB兩個亞家族，AhFATA亞家族有2個基因Aradu.J7RE1和Araip.D1M07，它們是一對等位基因，分別位于Aradu.A04和Araip.B04上。AhFATB亞家族有18個基因，其中包含7對等位基因，分別位于7對染色體上。由于Araip.T3UA2基因不完整，可能會使結果產生很大的誤差，所以不予分析。

2.2 多序列比對及進化分析

將AhFATs與其它物種FAT進行比對（圖1），發現FATA和FATB在N端差異極大，由此推測N端的差異可能是造成兩個亞家族底物特異性不同的原因。而且FATB的序列基本都比FATA的序列要長。所選其它物種兩個亞家族蛋白的氨基酸序列中都保留了三個類似木瓜蛋白酶類三聯體的保守殘基，而AhFAT個別序列中天冬酰胺N和組氨酸H與已知物種FATB和FATA序列中的保守殘基不同。FATA和FATB在第150至370氨基酸之間的核心區域保守性較高，表明兩亞家族之間存在著相似的高級結構和功能[7]。

利用MEGA5.0對19個AhFATs與其它17個物種的FAT蛋白序列進行比對，并構建系統進化樹（圖2）。結果顯示，FAT家族分成兩個大的分支，即FATA和FATB兩個亞家族，兩分支都具有高度的保守性；藻類植物單獨為一個分支，說明各植物FAT與藻類的親緣關系較遠。

在FATA亞家族分支中，苔蘚和蕨類植物單獨分為一支，單子葉和雙子葉植物也各自分為一支，花生Araip.D1M07和Aradu.J7RE1與苜蓿在同一分支上，表明兩者親緣關系較近。FATB亞家族基因數目比較大，分支也比較復雜，苔蘚和蕨類植物在同一分支上，單子葉植物和雙子植物還分為多個小的分支，這可能是由FATB亞家族的不同進化過程造成。AhFATB家族與大豆、苜蓿的親緣關系較近，而與棉花、毛果楊、油菜、蓖麻的親緣關系較遠。

2.3 跨膜結構域、保守結構域和亞細胞定位分析

利用TMHMM分析19個AhFATs的跨膜結構域，結果發現它們都不含有跨膜結構，屬于胞質可溶性蛋白。但是該家族的基因都含有保守的Acyl-ACP_TE結構域，是典型的植物硫酯酶家族成員。其中Aradu.8Y7VD、Araip.J6FGQ、Aradu.Q57RH、Aradu.J7RE1和Araip.D1M07都具有兩個Acyl-ACP_TE結構域。利用ProtComp 9.0預測AhFATs的亞細胞定位（表1），結果表明除了Araip.MR3NT的定位不夠明確外，其余AhFATs都定位在葉綠體中。

2.4 基因結構分析

通過對AhFATs的基因結構進行分析發現，AhFATA和AhFATB的基因結構有不同特點。AhFATA家族有2個成員，分別具有6個和8個外顯子。AhFATB家族基因結構比較復雜，它們的外顯子數目差別較大，從5個到8個不等（圖3）。等位基因的基因結構類似，如Aradu.J7RE1和Araip.D1M07，Aradu.ZG6C0和Araip.SBA9Y。有些基因的預測序列不完整，如Aradu.Q1LBD，其基因結構與Araip.1PE3B的3′端類似，而缺少5′端部分序列。

2.5 可變剪接事件預測

根據轉錄組數據對AhFAT的可變剪接事件進行預測，結果表明，在19個AhFATs中，有5個具有可變剪接現象，僅占26%（表2）。發生可變剪接的類型也較少，只有轉錄起始位點可變剪接（TSS）、轉錄終止位點可變剪接（TTS）和外顯子末端可變剪接（AE）。TSS發生頻率最高，有12次；其次是TTS，有6次；AE僅發生3次。不同AhFAT的可變剪接具有明顯的差異。AhFATA亞家族的兩個基因在四個組織中都發生了可變剪接。Aradu.J7RE1和Araip.D1M07都發生了TSS和TTS，其中基因Aradu.J7RE1還發生了AE。AhFATB家族基因雖然多，但是大多都沒有發生可變剪接，只有Araip.SBA9Y、Aradu.ZG6C0和Aradu.8Y7VD發生了可變剪接，僅占16.7%；其中Araip.SBA9Y和Aradu.ZG6C0均發生了TSS，Aradu.8Y7VD發生了AE和TTS。

2.6 表達模式分析

利用轉錄組數據中各基因的FPKM值對AhFATs的表達模式進行分析（圖4）。結果表明，在20個AhFATs中，Aradu.ZL5SD、Araip.RRH7G、Araip.4509F、Araip.3B5IK在四個組織中都不表達，Aradu.Q1LBD、Araip.T3UA2、Aradu.0EA4R、Araip.S1TFK、Aradu.B3QR0、Aradu.D1B7C、Araip.J6FGQ、Araip.MR3NT、Aradu.Q57RH、Araip.1PE3B只在一個或者兩個組織中表達，只有6個基因在四個組織中都表達。AhFATB亞家族基因的表達量總體而言高于AhFATA亞家族。AhFATA家族的兩個基因Aradu.J7RE1和Araip.D1M07在四個組織中均有表達，且在種子發育后期表達量較高。AhFATB亞家族中Araip.21S3V、Aradu.8Y7VD、Aradu.ZG6C0和Araip.SBA9Y在四個組織中也均有表達，Araip.21S3V和Aradu.8Y7VD在種子發育后期表達量最高，表明二者在花生種子油脂合成中具有主導作用；Aradu.ZG6C0和Araip.SBA9Y在葉中表達量最高，顯示出二者在葉片脂肪酸合成中的重要作用。

3 討論與結論

花生是我國重要的油料作物，但是花生油的價值和品質沒有橄欖等植物的油高，所以提高花生油品質成為了人們關注的重點。FAT能夠控制種子油脂肪酸組成和脂肪酸含量，所以對其進行深入研究可以為調控花生油脂肪酸組成提供一定理論基礎。本研究對花生基因組中19個AhFAT基因進行了全面的生物信息學分析，發現AhFATAs和AhFATBs且都具有保守的Acyl-ACP_TE結構域，表明兩個亞家族的基因具有相似的功能[13]。序列比對發現兩個亞家族的N端序列相似很低，由此推測N端的不同可能會造成它們的底物偏好性不同，這與王威浩等[7]發現植物FAT氨基酸序列的N端不保守性可能是進化過程中植物根據自身特點所作出的選擇這一結果相似。序列比對還發現AhFAT個別序列的天冬酰胺N和組氨酸H與有關報道中三個保守氨基酸催化位點有所不同，這兩個位點的變化可能會導致AhFAT催化活性的變化[28]。系統進化樹分析發現AhFATs分為AhFATA和AhFATB兩個大分支，FATA家族成員相對FATB家族成員少很多，僅占整個家族的30.5%，而且FATB家族的分支也比較復雜，由此推測FATB具有不同的進化途徑而造成FATB家族成員較多[29]。AhFATA和AhFATB與不同植物的FATA和FATB分別聚集在一起，說明AhFAT的進化與其它植物進化類似[30]。

選擇性剪接是真核生物基因功能調控的一種重要方式。它在每一個生物過程中都起著重要作用，包括調節細胞分裂和細胞死亡，調控胚胎和成體組織的分化，以及細胞對各種環境因素的反應[31]。對花生轉錄組數據分析發現，19個AhFAT基因只有少數產生了剪接事件，且在特定組織中發生，這與周晏秋[32]對獼猴桃組織特異性可變剪接事件研究結果相似。本研究發現AhFATA家族兩個基因在花生四個組織都發生可變剪接，且發生的種類多，說明這兩個基因的表達可能會受到可變剪接的調控[33，34]。

研究基因的表達模式對于了解基因的功能具有重要意義。利用轉錄組數據對AhFAT家族基因的表達模式進行分析發現，AhFATAs和AhFATBs都在種子發育后期表達量較高，推測AhFAT家族基因對調控花生種子油脂積累具有重要作用[24]。這與擬南芥中FATA活性降低后雖然沒有引起形態突變，但是導致擬南芥種子的含油量降為野生型含油量的50%的結果相一致[3]。陳高在研究AhFAT基因表達模式時發現AhFATB1基因在花中表達量最高；在花生果針入土第70天的種子中表達量達到最高峰[24]。AhFATB家族基因中Aradu.ZG6C0和Araip.SBA9Y在葉中表達量最高，表明其與葉片中脂肪酸合成相關。這個結果與先前擬南芥中FATB基因斷裂導致莖和葉中蠟質和磷脂含量降低的結果相符[15]。

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