酶法水解玉米漿制備玉米肽的研究

馬雪，李楊，王成法，張金鳳

(1.綏化學院 食品與制藥工程學院，黑龍江 綏化 152061；2.黑龍江龍鳳玉米開發有限公司，黑龍江 綏化 152000)

我國是真正的玉米淀粉生產大國，目前國內都是采用濕法來制備淀粉，市面上80%以上的淀粉都是以玉米為原料生產的[1]。每年生產玉米淀粉的同時也會有大量的玉米浸泡液產出，玉米浸泡濃縮液也稱玉米漿，是玉米濕法加工生產淀粉時的一種主要副產物。玉米漿中蛋白質含量很高[2]，在實際應用中通常采用噴霧干燥的方法制成干粉加到飼料中，或者直接作為“三廢”處理和排放掉[3]，若能對玉米漿中的蛋白質成分進一步開發利用，可大大提高玉米加工企業的經濟效益。

利用酶法對玉米蛋白進行水解生產玉米肽具有高安全性、高效性等特點[4,5]，而且，對玉米肽進行的研究表明：與玉米蛋白相比，玉米肽具有良好的溶解性，能夠在較大pH范圍內完全溶于水，無渾濁、沉淀現象[6]，具有高濃度、低粘度等功能特性，可應用于開發復合調味汁或高蛋白流體食品；還具有易消化吸收、促進微生物發酵、抗氧化活性等特性，可以作為生產醬油、酸奶、發酵火腿等發酵食品的添加劑；另外，還可以利用其抗疲勞、促進乙醇代謝等活性[7]，開發成運動飲料、醒酒飲料等功能飲料。所以，玉米肽可以被廣泛地用作保健食品、發酵調味食品及其他原料。酶水解法是目前生產活性肽的主要方法[8],是一種不完全的水解，因為蛋白質酶水解后并不是生成單個的氨基酸，它的產物是多肽。水解反應并沒有如鈉和水反應那樣劇烈，非常溫和地進行，而且反應很快、效率非常高，因為產物是多肽，所以原有的氨基酸沒有任何變化，此法制多肽不需要投入太大的人力、物力，只需將酶與底物混合好、控制好反應條件即可，而且反應水解很徹底，幾乎沒有殘留，雜質也很少。

本研究利用酶法對玉米漿進行水解制備多肽，通過不同的酶種類、溫度、時間、酶與底物比、pH值等單因素試驗和正交試驗確定最佳酶解工藝，研究結果對提高玉米漿蛋白的利用價值和開發具有生理活性的玉米肽產品具有實際指導意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米漿(黑龍江龍鳳玉米有限公司提供)；堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶(北京奧博星生物技術有限公司)；中性蛋白酶(武漢金科天成科技有限公司)；氨基乙酸、水合茚三酮、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、D-果糖、硼酸、氫氧化鈉、乙醇(均為分析純)；鹽酸(優級純)。

1.2 儀器設備

PHBJ-260型便攜式pH計 合肥卓爾儀器儀表有限公司；HH-S4電熱恒溫水浴鍋 金壇市岸頭國瑞實驗儀器廠；離心機 湖南星科科學儀器有限公司；PL203型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；SH220石墨消解儀、K9840自動凱氏定氮儀 濟南海力儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預處理

玉米漿需要加熱破壞玉米蛋白的穩定結構使其可以被蛋白酶水解。而且試驗材料是濕法制玉米淀粉的副產物玉米漿，里面含有其他酶類。因此，本試驗采用熱處理即沸水浴30 min使玉米漿蛋白變性并且使其他雜酶失活，避免其影響試驗。

1.3.2 原料中蛋白質的含量測定

利用凱氏定氮法測定原料中蛋白質的含量。主要目的是確定試驗不同酶與底物比時酶的用量。

1.3.3 蛋白質水解度的測定[9]

用甘氨酸做標準氨基酸并配制合適濃度梯度的標準溶液，同時做空白試驗，在分光光度計570 nm處測定吸光度A值。以甘氨酸濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。取水解后的樣品液0.1 mL于100 mL容量瓶中并且定容，然后從容量瓶中取0.40 mL試液于具塞比色管中，然后加入1.0 mL指示劑和1.6 mL蒸餾水，混勻，加熱滅酶，冷卻后加入5 mL的40%乙醇溶液，混勻后放置15 min，同時做空白試驗，于570 nm處測定A值，利用標準曲線可知水解液中-NH2基的含量。

水解度：DH(%)=h/htot×100%=(水解液中-NH2基的含量-水解前-NH2基的含量)×100%/htot。

式中：h為每1 g水解物中被裂解的肽鍵毫摩爾數(mmol/g protein)；htot為每1 g原料蛋白質中總的肽鍵毫摩爾數(mmol/g protein)，玉米蛋白的htot為9.2。

1.3.4 不同酶對玉米漿蛋白水解度影響的研究

稱取經預處理的玉米漿4份，每份15 g，蛋白質質量分數均為32%，按酶與底物比3%(W/W，底物重量按蛋白質質量計)的添加量依次添加堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶，調節pH、溫度至各種酶理論最適值，酶解4 h后，加熱滅酶10 min，于3000 r/min離心10 min，然后按1.3.3中樣品檢測方法操作，測定吸光度值A，計算水解度。選出水解度最高的酶作為試驗用酶。

1.3.5 中性蛋白酶水解條件的確定

1.3.5.1 pH對水解度的影響

稱取經預處理的玉米漿5份，每份15 g，蛋白質質量分數均為32%，分別加入中性蛋白酶3%(W/W，底物重量按蛋白質質量計)，5份玉米漿pH值在6.5～8.5之間平均相差0.5，在50 ℃下反應4 h后，加熱滅酶10 min，于3000 r/min離心10 min，然后按1.3.3中樣品檢測方法操作，測定吸光度值A，計算水解度。

1.3.5.2 酶與底物比對水解度的影響

稱取經預處理的玉米漿5份，每份15 g，蛋白質質量分數均為32%，5份樣品按酶與底物比(E/S)從1.5%開始遞增至4.0%，相鄰樣品差值為0.5%加入中性蛋白酶，并用NaOH溶液把玉米漿pH調節到7.5，在50 ℃下反應4 h后，加熱滅酶10 min，于3000 r/min離心10 min，然后按1.3.3中樣品檢測方法操作，測定吸光度值A，計算水解度。

1.3.5.3 時間對水解度的影響

稱取經預處理的玉米漿5份，每份15 g，蛋白質質量分數均為32%，分別加入中性蛋白酶3%(W/W，底物重量按蛋白質質量計)，調整玉米漿pH值至7.5，在50 ℃下水解，5份樣品反應時間在2～6 h之間，每隔1 h取1個樣品加熱滅酶10 min，于3000 r/min離心10 min，然后按1.3.3中樣品檢測方法操作，測定吸光度值A，計算水解度。

1.3.5.4 溫度對水解度的影響

稱取經預處理的玉米漿5份，每份15 g，蛋白質質量分數均為32%，分別加入中性蛋白酶3%(W/W，底物重量按蛋白質質量計)，并用NaOH溶液把玉米漿pH調節到7.5，5份溶液的水解溫度分別在40～60 ℃之間平均相差5 ℃，反應4 h后加熱滅酶10 min，于3000 r/min離心10 min，然后按1.3.3中樣品檢測方法操作，測定吸光度值A，計算水解度。

1.3.6 正交試驗設計

選取單因素試驗結果分析中的顯著因素，采用L9(34)正交試驗設計，確定最佳酶解條件，試驗因素水平表見表1。

表1 L9(34)正交試驗因素水平表

2 結果與分析

2.1 不同酶對玉米漿蛋白水解度影響的研究

通過對4種不同酶的水解度進行測定，堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶對玉米漿蛋白的水解度分別為28.67%，36.17%，24.12%，18.43%。由水解度結果可知，中性蛋白酶的水解度最高，最終選擇中性蛋白酶作為制備玉米肽的水解酶。

2.2 中性蛋白酶水解條件的確定

2.2.1 pH對玉米漿蛋白水解度的影響

pH對玉米漿蛋白水解度的影響結果見圖1。

圖1 pH對玉米漿蛋白水解度的影響

由圖1可知，水解度達到最大值41.7%時溶液pH為7.5。在pH超過7.5后水解度一直在減少，由此可知所用蛋白酶的活力最高pH值為7.5，pH值大于或者小于7.5都會影響到中性蛋白酶的活力，從而影響到中性蛋白酶對玉米漿的水解效果。

2.2.2 酶與底物比對玉米漿蛋白水解度的影響

酶與底物比對玉米漿蛋白水解度的影響結果見圖2。

圖2 酶與底物比對玉米漿蛋白水解度的影響

由圖2可知，酶與底物比為1.5%時水解度最低，之后水解度開始增加，而且其水解度達到較大的峰值32.4%時酶與底物比為3.0%，當酶與底物比大于3%時，隨著酶與底物比進一步提高，其水解度上升趨勢非常小甚至不再增加。因為當酶與底物比較低時，酶與所有底物結合，反應速度隨著酶與底物比的升高而增加，酶與底物比較高時，底物量相對就少，因此多余的酶不能與玉米漿蛋白底物結合，水解度隨著酶與底物比的增大而緩慢上升直至達到平衡。從生產的經濟效益方面考慮，酶與底物比3%時為最佳，水解效率高且節約用酶量。

2.2.3 時間對玉米漿蛋白水解度的影響

時間對玉米漿蛋白水解度的影響結果見圖3。

圖3 時間對玉米漿蛋白水解度的影響

由圖3可知，玉米漿蛋白水解度在5 h前一直在增加，在5 h后水解度增幅很小，達到峰值35.5%，5 h和6 h后水解度值幾乎沒有變化。這是因為5 h后底物蛋白幾乎被水解完全，因此水解度也就幾乎不再增加，從生產成本和經濟效益方面考慮，5 h為最佳水解時間。

2.2.4 溫度對玉米漿蛋白水解度的影響

溫度對玉米漿蛋白水解度的影響結果見圖4。

圖4 溫度對玉米漿蛋白水解度的影響

由圖4可知，在溫度升高時水解度也隨之增加，玉米漿蛋白水解度在55 ℃時達到最高值38.6%，然后隨著溫度升高而逐漸降低。這是因為中性蛋白酶在溫度升高到酶活力最高的溫度時水解效率最高，大于或者小于這個溫度就會使酶的活性降低，從而使玉米漿蛋白水解度變低，因此最佳水解溫度為55 ℃。

2.2.5 正交試驗結果

根據因素水平表進行的正交試驗結果見表2。

表2 中性蛋白酶水解玉米漿正交試驗結果

續 表

通過極差分析，各因素影響水解度的順序為C>B>D>A，即時間影響最明顯，酶與底物比次之，然后是溫度，影響最小的是pH值，由K值分析得最好的水平搭配是A2B2C3D2。通過驗證試驗得到水解度為44.5%，大于其他水解值結果，即采用中性蛋白酶水解玉米漿的最佳條件是溫度55 ℃、pH值7.5、酶與底物比3%(W/W)、水解時間6 h。在此條件下，中性蛋白酶水解玉米蛋白粉的水解度最高可達到44.5%。

3 結論

通過對不同酶、pH值、溫度、時間、酶與底物比的單因素試驗和正交試驗，確定酶法制備玉米漿蛋白的最佳酶解工藝，由試驗得到結論：以水解度為指標，中性蛋白酶對玉米漿蛋白水解度的影響較大，當中性蛋白酶與底物玉米漿中蛋白質質量比為3%、溫度為55 ℃、pH值為7.5的條件下水解6 h時，玉米漿蛋白水解度最高可達到44.5%，此時酶解效果最好。該研究為玉米漿原料的再利用提供了一定的理論基礎，為玉米肽的生產提供了數據參考。